HOLOTYPE HLA™ 96/11 – CONFIGURATION A ET CE ET CONFIGURATION B ET CE (RÉF. : H32 ET RÉF. : H34) MODE D'EMPLOI VERSION 1 02/05/2018 Réservé à un usage diagnostique in vitro

V1 0086

Prépare l'ADN à l'analyse par séquençage sur le séquenceur Illumina MiSeq





Table des matières INFORMATIONS SUR LE FABRICANT ........................................................................................................... 7 EXPLICATION DES SYMBOLES ..................................................................................................................... 7 HOLOTYPE HLA-96/11 – CONFIGURATION A ET CE (RÉF. : H32) OU CONFIGURATION B ET CE (RÉF. : H34) – CONTENU DU KIT ........................................................................................................................................ 8 COFFRET DE COMPOSANTS D'AMORCES ............................................................................................................................. 8 COFFRET COMPOSANT DE REACTIFS DE PREPARATION DE BANQUES ......................................................................................... 8 PLAQUE D'ADAPTATEURS A 96 PUITS ................................................................................................................................ 9 CLASSEUR EXCEL ........................................................................................................................................................... 9 LOGICIEL – OMIXON HLA TWIN ...................................................................................................................................... 9 EXPEDITION ET STOCKAGE .......................................................................................................................... 9 AVERTISSEMENTS ET MISES EN GARDE ..................................................................................................... 10 LIMITATIONS CONNUES DES PRODUITS ............................................................................................................................ 10 INFORMATIONS RELATIVES A LA SECURITE ............................................................................................... 10 PARAMETRES DE PERFORMANCE ............................................................................................................. 11 ASSISTANCE TECHNIQUE .......................................................................................................................... 11 Assistance téléphonique : ....................................................................................................................... 11 ÉQUIPEMENT, REACTIFS ET FOURNITURES ............................................................................................... 12 RECOMMANDATIONS EN MATIERE D'EQUIPEMENT TECHNIQUE ............................................................................................. 12 RECOMMANDATIONS EN MATIERE DE REACTIFS ASSOCIES .................................................................................................... 12 Capacité du kit de réactifs MiSeq ........................................................................................................... 13 FOURNITURES RECOMMANDEES .................................................................................................................................... 13 MENTION LEGALE ..................................................................................................................................... 14 UTILISATION PREVUE ............................................................................................................................... 14 NOTE IMPORTANTE AVANT UTILISATION ................................................................................................. 15 RECOMMANDATION EN MATIERE D'ISOLATION DE L'ADN GENOMIQUE ................................................................................. 15 PRINCIPE DE LA METHODE ........................................................................................................................ 16 RESUME DES ETAPES ................................................................................................................................ 17 GLOSSAIRE/DEFINITIONS .......................................................................................................................... 18 ÉTAPE 1 – PREPARATION DU MELANGE DE REFERENCE POUR L'AMPLIFICATION HLA ............................... 19 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 19 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 19 Mélange de référence : HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 et DQA1 .................................... 20 Mélange de référence : HLA-DRB4 ......................................................................................................... 20 Mélange de référence : HLA-DQB1 Set 3 ................................................................................................ 20 ÉTAPE 2 – AMPLIFICATION DES HLA DE CLASSE I ET II ............................................................................... 21 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 21 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 21 Mélange de référence chargé de Taq polymérase : HLA-A, B, C, DRB1/3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 et DQA1 ...................................................................................................................................................... 22 Omixon Holotype 96/11 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Mélange de référence chargé de Taq polymérase : HLA-DQB1 Set 3 ..................................................... 22 Amplification de classe I (HLA-A, B et C) ................................................................................................ 22 Amplification de classe II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 et DQB1) ...................... 23 Tailles attendues des amplicons ............................................................................................................. 23 ÉTAPE 3 – QUANTIFICATION ET NORMALISATION DES AMPLICONS (A L'AIDE D'UN FLUOROMETRE DE PLAQUE) ................................................................................................................................................... 24 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 24 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 25 Regroupement des amplicons ................................................................................................................ 26 Purification des produits de PCR avec ExoSAP-IT Express ...................................................................... 26 ÉTAPE 4 – PREPARATION DES BANQUES ................................................................................................... 27 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 27 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 27 Mélange de référence de fragmentation ............................................................................................... 28 Programme de fragmentation ............................................................................................................... 28 Mélange de référence de réparation des extrémités ............................................................................. 29 Programme de réparation des extrémités ............................................................................................. 29 Mélange de référence de ligation .......................................................................................................... 30 Programme de ligation .......................................................................................................................... 30 Regroupement et purification des banques ........................................................................................... 31 ÉTAPE 5 – SELECTION DE LA TAILLE DES FRAGMENTS DE LA BANQUE ....................................................... 33 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 33 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 33 ÉTAPE 6 – QUANTIFICATION DE LA BANQUE AU MOYEN DE L'APPAREIL QPCR ......................................... 34 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 34 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 34 Mélange d'amorces qPCR ...................................................................................................................... 34 Mélange de référence qPCR ................................................................................................................... 35 ÉTAPE 7 – SEQUENÇAGE SUR LE SYSTEME ILLUMINA MISEQ ..................................................................... 37 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 37 Capacité du kit de réactifs MiSeq ........................................................................................................... 37 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 37 ÉTAPE 8 – ANALYSE DES DONNEES DE SEQUENÇAGE HLA ......................................................................... 39 PROTOCOLE AUTOMATISE ............................................................................................................................................. 39 Paramétrage et configuration informatique .......................................................................................... 39 Protocole par analyse ............................................................................................................................. 39 PROTOCOLE MANUEL SERVEUR ...................................................................................................................................... 39 Paramétrage et configuration informatique .......................................................................................... 39 Protocole par analyse ............................................................................................................................. 39 PROTOCOLE MANUEL BUREAU ...................................................................................................................................... 40 Paramétrage et configuration informatique .......................................................................................... 40 Protocole par analyse ............................................................................................................................. 40 FIGURES SUPPLEMENTAIRES .................................................................................................................... 41 EXEMPLES DE PLAQUES D'AMPLICONS, D'AMPLIFICATION, DE DILUTION, DE QUANTIFICATION DES AMPLICONS (POUR UN LOCUS INDIVIDUEL) ET DE REACTIONS ....................................................................................................................................... 41 EXEMPLE DE PLAQUE DE QUANTIFICATION DES ETALONS ..................................................................................................... 41 Omixon Holotype 96/11 – CONFIGURATION | Configuration A et CE et Configuration B et CE | Mode d'emploi, version 1. 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EXEMPLE DE PLAQUE QPCR DE QUANTIFICATION DES BANQUES KAPA .................................................................................. 42 ANNEXE 1 : SELECTEUR AUTOMATISE PIPPIN PREP ................................................................................... 43 PROGRAMMATION DU PIPPIN PREP ................................................................................................................................ 43 UTILISATION DU SELECTEUR AUTOMATISE PIPPIN PREP ....................................................................................................... 43 ANNEXE 2 : QUANTIFICATION DES AMPLICONS AU MOYEN D'UN APPAREIL QPCR ................................... 46 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 46 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 46 ANNEXE 3 : QUANTIFICATION D'UNE BANQUE UTILISANT UN MARQUEUR COULEUR FLUORESCENT DSDNA INTERCALAIRE .......................................................................................................................................... 48 LISTE DES REACTIFS ..................................................................................................................................................... 48 PROTOCOLE ............................................................................................................................................................... 48



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Historique du document – Notes et mises à jour importantes Version Date V1

Auteur

14/12/2017 Tünde Vágó

Résumé des modifications Première version

Autorisé par Date d’emission Efi Melista 02/05/2018

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Clause de non-responsabilité Omixon a mis tout en œuvre pour s'assurer de l'exactitude du présent mode d'emploi. Omixon décline toute responsabilité en cas d'inexactitudes ou d'omissions qu'il pourrait contenir. Les informations fournies dans ce mode d'emploi sont sujettes à modification sans préavis. Omixon n'assume aucune responsabilité vis-à-vis de toute inexactitude que le présent mode d'emploi pourrait inclure. Omixon se réserve le droit d'apporter des améliorations à ce mode d'emploi et/ou aux produits qui y sont décrits, à tout moment et sans préavis. Dans le cas où vous trouveriez dans ce manuel des informations incorrectes, trompeuses ou incomplètes, vos commentaires et suggestions seront les bienvenus. Veuillez nous les faire parvenir à l'adresse [email protected].

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Informations sur le fabricant Raison sociale : Omixon Biocomputing Ltd Adresse de visite : Fehérvári út 50-52/6 Ville : Budapest Code postal : H-1117 Pays : Hongrie

Explication des symboles Numéro de lot Numéro de référence Consulter le mode d'emploi Contient des réactifs pour un nombre N de tests Fabricant légal. La date jointe apposée à côté de ce symbole est la date de fabrication. Température de stockage recommandée

Date de péremption

Dispositif médical pour diagnostic in vitro

Composant de remplacement

Contient un composant de remplacement

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Holotype HLA-96/11 – Configuration A et CE (RÉF. : H32) ou Configuration B et CE (RÉF. : H34) – Contenu du kit Coffret de composants d'amorces Le coffret de composants d'amorces fournit des solutions d'amorce prêtes à l'emploi pour l'amplification ciblée de la PCR à longue portée des gènes HLA A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DPA, DPB1, DQA1 et DQB1. De plus, il contient également deux types d'additifs de la PCR (Amplificateur 1 et Amplificateur 2). Mélange d'amorces HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DRB1/3 HLA-DRB4 HLA-DRB5 HLA-DPA1 HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 (Set 3) Amplificateur 1 Amplificateur 2

N° DE RÉF. P012 P022 P032 P042 P072 P112 P132 P072 P082 P122 E01 E02

Rxns 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96

Vol./ Nbre de Code tube tubes couleur 220 µl 1 Jaune 220 µl 1 Rouge 220 µl 1 Orange 220 µl 1 Vert 220 µl 1 Blanc 220 µl 1 Rose 220 µl 1 Noir 220 µl 1 Mauve 220 µl 1 Brun 220 µl 1 Bleu 1100 µl 1 Transparent 300 µl 1 Transparent

Coffret Composant de réactifs de préparation de banques Le coffret de composants de préparation de banques contient les réactifs permettant la préparation de banques (fragmentation, réparation et adénylation des extrémités des amplicons et ligation des séquences d'adaptateurs indexés) depuis les amplicons HLA. Réactif Enzyme de fragmentation (A) Tampon de fragmentation (B) Enzyme de réparation des extrémités (C) Tampon de réparation des extrémités (D) Enzyme de ligation (E) Tampon de ligation (F)

N° DE RÉF. R11 R21 R31 R41 R51 R61

Rxns 96 96 96 96 96 96

Vol./ Nbre de tube tubes 278 µl 1 278 µl 1 162 µl 1 324 µl 1 324 µl 1 1800 µl 2

Code couleur Jaune Rouge Vert Orange Bleu Noir

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Plaque d'adaptateurs à 96 puits Le composant Plaque d'adaptateurs indexés à 96 puits contient des adaptateurs NGS indexés prêts à l'emploi (oligonucléotides d'ADN double brin) en solution de 5 µl, pour la génération de banques NGS individuelles. La plaque d'adaptateurs indexés à 96 puits contient un nombre suffisant d'adaptateurs indexés pour la génération de 96 banques NGS individuelles et pour l'identification des échantillons en aval. Version du N° DE Réactif kit RÉF. H32 Plaque d'adaptateurs A (i1-96) N1 H34 Plaque d'adaptateurs B (i97-192) N2

Rxns

Vol./puits

96 96

5 µl 5 µl

Nbre de plaques 1 1

Classeur Excel Un classeur Excel est fourni afin de prendre en charge les calculs, les agencements de plaque et la tenue des dossiers du protocole Holotype HLA 96/11, la création des fiches d'échantillon MiSeq et plus encore. Si vous n'en possédez pas un exemplaire, veuillez contacter [email protected].

Logiciel – Omixon HLA Twin Contactez [email protected] pour obtenir les crédits Omixon HLA Twin associés à votre acquisition du kit Holotype HLA 96/11.

Note importante : Utilisez les trois composants du kit Omixon Holotype HLA 96/11 et le logiciel Omixon HLA Twin conjointement afin de constituer un flux de travail d'utilisation diagnostique in vitro. Veuillez consulter le chapitre consacré aux avertissements et mises en garde associés aux limitations d'utilisation des produits. Les composants de remplacement sont disponibles sur demande expresse des utilisateurs. Veuillez noter que les remplacements sont fournis par Omixon pour des coffrets de composants, et non pour des flacons individuels. Pour plus d'informations, veuillez contacter [email protected].

Expédition et stockage Les produits sont expédiés sur des cryopacks dans des emballages en Styrofoam et doivent être stockés à -20 °C dès leur arrivée. Veuillez valider le processus de contrôle et de surveillance de température de vos congélateurs et le réviser régulièrement. Les kits non ouverts sont stables jusqu'à leur date de péremption (indiquée sur l'étiquette du kit) lorsqu'ils sont stockés à -20 °C. Une fois le produit ouvert, il est recommandé de respecter un maximum de 4 (quatre) cycles de congélation/décongélation afin de garantir la stabilité du produit. Les kits ouverts sont stables jusqu'à 3 mois lorsqu'ils sont stockés à -20 °C. Omixon Holotype 96/11 – CONFIGURATION | Configuration A et CE et Configuration B et CE | Mode d'emploi, version 1. Réservé à un usage diagnostique in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel et exclusif. Page 9 │ 49



Avertissements et mises en garde Limitations d'utilisation des produits Afin de bénéficier des meilleures performances, veuillez appliquer le flux de travail du kit Holotype HLA 24/7 et le logiciel Omixon HLA Twin lors du typage HLA par NGS avec les matériaux, réactifs et équipement recommandés au chapitre « Équipement et réactifs ». L'utilisation de matériaux autres que ceux spécifiés au chapitre « Équipement et réactifs » doit être vérifiée et validée par l'utilisateur. Ne procédez pas à la reconstitution ou à la dilution des réactifs dans des volumes autres que ceux indiqués dans le présent mode d'emploi. N'utilisez pas un volume des réactifs inférieur à celui indiqué dans le présent mode d'emploi. Le non-respect de ces indications peut conduire à des erreurs de performance. Omixon ne saurait fournir une assistance en cas de problèmes résultant du non-respect des étapes du protocole décrites dans le présent mode d'emploi. N'utilisez pas le produit en cas de dommage visible de ses composants (flacons cassés, plaque rompue, capuchons desserrés, etc.).

Limitations connues des produits Veuillez vous référer au document intitulé Product Known Limitations Guide (Guide des limitations connues des produits) afin de connaître les limitations et ambiguïtés logicielles du produit Holotype HLA. Ce guide est distribué conjointement au mode d'emploi mais se trouve également sur le site Web Omixon sous MyHolotype/Support et Services/HLA Twin Instructions for Use, ou est disponible sur simple demande à l'adresse [email protected].

Informations relatives à la sécurité Avant de commencer, veuillez lire les paragraphes « Informations relatives à la sécurité » et « Notes importantes » concernant les réactifs ou les kits indiqués au chapitre « Équipement, réactifs et fournitures ». Lorsque vous employez des produits chimiques, portez une blouse de laboratoire adéquate, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d'informations, veuillez consulter les FDS (Fiches de données de sécurité) appropriées mises à disposition par le fournisseur du produit concerné. Un descriptif des composants chimiques des réactifs est fourni dans les FDS du kit Holotype HLA 96/11, disponibles sur simple demande. Procédez à l'élimination des composants du produit en tant que déchets médicaux généraux.

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Paramètres de performance Principaux paramètres de performance établis conformément à la validation du produit.

HLA-A

HLA-B

HLA-DRB1

HLA-C

HLA-DPB1

HLA-DQA1

HLA-DQB1

Sensibilité

99,054 %

99,171 %

98,335 %

96,310 %

98,818 %

98,927 %

95,724 %

Spécificité

99,966 %

99,982 %

99,956 %

99,863 %

99,946 %

99,881 %

99,775 %

Précision

99,054 %

99,171 %

98,335 %

96,310 %

98,818 %

98,927 %

95,724 %

Exactitude

99,935 %

99,965 %

99,915 %

99,736 %

99,897 %

99,785 %

99,572 %

Reproductibilité 100,00 %

100,00 %

99,28 %

100,00 %

99,28 %

100,00 %

99,28 %

Répétabilité

100,00 %

100,00 %

100,00 %

100,00 %

100,00 %

100,00 %

100,00 %

Assistance technique Pour une assistance générale relative à ce protocole, veuillez contacter [email protected].

Assistance téléphonique : États-Unis | +1 (617) 500 07 90 Europe | +36 (70) 574 80 01 Autres pays | +1 (617) 500 07 90

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Équipement, réactifs et fournitures Recommandations en matière d'équipement technique § Thermocycleur au format 96 puits § Fluoromètre de plaque (ou tout instrument capable de détecter la fluorescence des plaques au format 96 puits, utilisable avec le système Promega QuantiFluor dsDNA) § Sélecteur automatisé Pippin Prep (RÉF. PIP0001) ou Blue Pippin (RÉF. BLU0001) de SAGE Science § Instrument qPCR pour plaques au format 96 ou 384 puits § Fluoromètre Qubit (RÉF. Q33216) de Thermo Fisher Scientific (facultatif) § Séquenceur Illumina MiSeq (RÉF. SY-410-1003) § Ordinateur en 64 bits avec au minimum 4 cœurs et 16 Go de RAM § Supports de stockage de données à long terme (approximativement 2 To de données par séquenceur MiSeq et par an)

Recommandations en matière de réactifs associés § Kits LongRange PCR de Qiagen (RÉF. 206401, 206402 ou 206403) § Chaque échantillon requiert 4,4 µl de Taq polymérase. § Le kit LongRange PCR (20) RÉF. 206401 contient 8 µl de Taq polymérase. § Le kit LongRange PCR (100) RÉF. 206402 contient 40 µl de Taq polymérase. § Le kit LongRange PCR (250) RÉF. 206403 contient 100 µl de Taq polymérase. § ExoSAP-IT de Affymetrix (RÉF. 75001-200, 75001-1ML, 75001-4X-1ML ou 75001-10ML) § Chaque échantillon groupé requiert 4 µl d'enzyme ExoSAP-IT. § Le réactif RÉF. 75001-200 contient 200 µl d'enzyme ExoSAP-IT Express. § Le réactif RÉF. 75001-1-ML contient 1 ml d'enzyme ExoSAP-IT Express. § Le réactif RÉF. 75001-4X-1ML contient 4 ml d'enzyme ExoSAP-IT Express. § Le réactif RÉF. 75001-10ML contient 10 ml d'enzyme ExoSAP-IT Express. § Kit Library Quantification – Illumina/Universal de KAPA Biosystems (RÉF. KK4824) § Kit de test Qubit dsDNA BR Assay (RÉF. Q32850 ou Q32853) (facultatif) § Le kit RÉF. Q32850 contient 100 tests. § Le kit RÉF. Q32853 contient 500 tests. § Système QuantiFluor dsDNA de Promega (RÉF. E2670) § Kit de billes Agencourt AMPure XP beads de Beckman Coulter (RÉF. A63880, A63881 ou A63882) § Chaque exécution Holotype HLA requiert un maximum de 900 µl de billes AMpure XP. § Le kit RÉF. A63880 contient 5 ml de billes AMPure XP. § Le kit RÉF. A63881 contient 60 ml de billes AMPure XP. § Le kit RÉF. A63882 contient 450 ml de billes AMPure XP. § Cassette de gel à 1,5 % d'agarose, sans colorant avec étalon interne (Marqueur K/R2), pour le sélecteur automatisé Pippin Prep/Blue Pippin (RÉF. CDF1510 pour le Pippin Prep et RÉF. BDF1510 pour le Blue Pippin) Omixon Holotype 96/11 – CONFIGURATION | Configuration A et CE et Configuration B et CE | Mode d'emploi, version 1. Réservé à un usage diagnostique in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel et exclusif. Page 12 │ 49



§ § § § §

Éthanol de qualité moléculaire (alcool anhydre) Eau de qualité moléculaire (exempte de DNase et RNase) Hydroxyde de sodium Tampon TE 1× (pH 8,0) Kit de réactifs MiSeq de Illumina

Capacité du kit de réactifs MiSeq Kit de réactifs Illumina MiSeq Std 500 Cycle (MS-102-2003)

Std 300 Cycle (MS-102-2002)

Micro 300 Cycle (MS-103-1002)

Nano 500 Cycle (MS-103-1003)

Nano 300 Cycle (MS-103-1001)

Temps Heures

Échantillons 96/11

~39

96

~24

72

~19

20

~28

8

~17

4

Fournitures recommandées § Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml § Tubes de microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml § Tubes de microcentrifugation à liaison faible de 2,0 ml (tubes Eppendorf DNA LoBind RÉF. 022431048 recommandés) § Tubes à paroi mince de 0,5 ml pour appareil Qubit (tubes à essai Qubit RÉF. Q32856 recommandés) § Pipettes à volume réglable (capacité de 1,0 à 1000 µl) § Pipettes à volume réglable à 8 canaux (capacité de 1,0 à 100 µl) § Plaques à 96 puits compatibles avec le thermocycleur § Plaques optiques à 96 puits compatibles avec le fluoromètre de plaque § Plaques à 96 puits compatibles avec l'appareil qPCR § Film de scellage pour plaque d'usage général § Film de scellage pour plaque compatible avec le thermocycleur (testé pour la PCR à longue portée) § Film de scellage pour plaque optique compatible avec l'appareil qPCR (facultatif) § Support magnétique compatible avec les tubes de microcentrifugation de 2 ml § Portoirs de refroidissement 96 puits (2 pièces) § Tubes coniques de 50 ml § Réservoirs de 50 ml

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Mention légale Le mode d'emploi du produit Holotype HLA 96/11 et son contenu sont la propriété d'Omixon Biocomputing Limited (« Omixon »), et sont conçus aux fins du seul usage contractuel de ses clients en ce qui concerne le ou les produit(s) décrit(s) dans ce document et à nulle autre fin. Le présent document et son contenu ne seront pas utilisés ni distribués à toute autre fin ni autrement communiqués, divulgués ou reproduits par quelque moyen que ce soit sans le consentement écrit préalable d'Omixon. Par le présent document, Omixon n'accorde aucune licence en vertu de ses brevet, marque de commerce, droit d'auteur ou droits dits de « common law » ni droits similaires de toute tierce partie. Le logiciel Omixon HLA Twin (« logiciel ») est utilisé sous licence par le client dans les conditions générales de vente définies dans le CLUF d'Omixon HLA Twin (www.omixon.com/hla-twin-eula/). Si vous n'acceptez pas les présentes conditions générales de vente, Omixon ne vous accorde pas de licence du logiciel, et vous ne devez pas utiliser ou installer le logiciel. Les instructions contenues dans ce document doivent être strictement et explicitement suivies par un personnel qualifié et dûment formé afin d'assurer l'utilisation sûre et appropriée du ou des produit(s) décrit(s) aux présentes. La lecture et la bonne compréhension du contenu de ce document dans son intégralité préalablement à l'utilisation de ce ou ces produit(s) sont incontournables. TOUT MANQUEMENT À LA LECTURE INTÉGRALE ET AU STRICT SUIVI DE LA TOTALITÉ DES INSTRUCTIONS CONTENUES DANS LE PRÉSENT DOCUMENT PEUT CONDUIRE À DES DOMMAGES MATÉRIELS DU/DES PRODUIT(S), À DES DOMMAGES CORPORELS AUX PERSONNES, NOTAMMENT AUX UTILISATEURS ET AUTRES TIERS, AINSI QU'À DES DOMMAGES MATÉRIELS À LA PROPRIÉTÉ D'AUTRUI. OMIXON N'ASSUME AUCUNE RESPONSABILITÉ DÉCOULANT DE L'USAGE INAPPROPRIÉ DU OU DES PRODUIT(S) DÉCRIT(S) AUX PRÉSENTES (Y COMPRIS LES PIÈCES OU LE LOGICIEL DUDIT PRODUIT) OU DE TOUT USAGE DU OU DESDIT(S) PRODUIT(S) HORS DU CHAMP D'APPLICATION DES LICENCES OU AUTORISATIONS ÉCRITES EXPRESSES ACCORDÉES PAR OMIXON EN RELATION AVEC L'ACQUISITION DE TEL(S) PRODUIT(S) PAR LE CLIENT. RÉSERVÉ À UN USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO © 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Tous droits réservés.

Utilisation prévue Le produit Holotype HLA 96/11 – Configuration A et CE et Configuration B et CE (ci-après nommé « Holotype HLA ») est une combinaison de réactifs pour test diagnostique in vitro et du logiciel d'analyse de données (Omixon HLA Twin™). Il est conçu pour permettre l'identification et la définition des HLA (human leukocyte antigens, antigènes des leucocytes humains) de classe I et II dans le cadre d'un typage HLA utilisant la plateforme Illumina® MiSeq Next Generation Sequencing. Le produit Holotype HLA fournit des informations sur l'histocompatibilité des loci HLA Omixon Holotype 96/11 – CONFIGURATION | Configuration A et CE et Configuration B et CE | Mode d'emploi, version 1. Réservé à un usage diagnostique in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel et exclusif. Page 14 │ 49



de classe I (A, B et C) et de classe II (DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 et DRB5) en utilisant l'ADN génomique humain. Le logiciel Omixon HLA Twin™ inclus dans le produit Holotype HLA est conçu pour l'interprétation et la corrélation des données de séquençage générées sur le système Illumina® MiSeq avec pour résultat un typage HLA au niveau des allèles en une seule passe de haute précision, doté d'un très faible taux d'ambiguïté à un niveau de 2 décimales. Le produit Holotype HLA est conçu pour un usage diagnostique in vitro par un personnel médical professionnel, tel que des techniciens de laboratoire et des médecins, dûment formés au typage HLA dans des laboratoires de diagnostic agréés EFI ou ASHI ou possédant la capacité requise pour travailler conformément aux spécifications EFI ou ASHI.

Note importante avant utilisation Recommandation en matière d'isolation de l'ADN génomique L'ADN génomique humain doit être préparé à l'aide de kits de préparation de l'ADN correctement testés, disponibles dans le commerce, afin d'assurer la constance de la préparation. Quelle que soit l'approche, la détermination précise de la concentration et de la pureté est requise pour assurer une solide performance du test. L'ADN doit être exempt de contaminants (p. ex. alcool, sels, détergents, formaldéhyde et héparine) qui pourraient compromettre l'amplification, la préparation des banques et les étapes de séquençage à un stade ultérieur. Le sang ne doit pas être prélevé dans des tubes héparinés, et des échantillons sanguins prélevés chez des patients traités sous héparine, de même que des échantillons lipémiques ou hémolysés ne doivent pas être utilisés. L'ADN génomique préparé peut être utilisé immédiatement s'il a été préparé dans de l'eau exempte de nucléase, ou stocké pour des périodes prolongées à une température de -20 °C ou moins. Nous recommandons l'utilisation d'eau pour la préparation de l'ADN génomique car l'EDTA contenu dans le tampon TE peut inhiber les réactions de la PCR à longue portée. Les décongélations répétées doivent être évitées pour réduire les risques de dégradation. Une concentration de 20 à 30 ng/µl de l'ADN est fortement recommandée pour obtenir un intrant de 100 à 150 ng d'ADN génomique par amplification de PCR. Nous recommandons fortement d'utiliser une méthode de quantification basée sur la fluorescence pour déterminer la concentration du gADN. Un rapport d'absorption des valeurs 260 nm/280 nm et 260 nm/230 nm de 1,7 à 2 est fortement recommandé. Pour l'amplification de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 et HLA-DQB1, 1,0 à 1,5 µg d'ADN génomique est requis.

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Principe de la méthode Pendant de nombreuses années, la communauté HLA a travaillé au développement d'une méthode qui identifierait avec précision le polymorphisme extensif des gènes HLA et de leurs produits géniques. L'avènement de la PCR, combinée à d'autres technologies (séquençage Sanger, SSOP, SSP, Luminex), a fourni une formule améliorant sensiblement la détection du polymorphisme HLA mais plusieurs limitations subsistaient néanmoins, qui continuaient d'entraver notre capacité à caractériser les gènes HLA de manière exhaustive. Les technologies développées ces dernières années, globalement appelées NGS (Next Generation Sequencing, Séquençage de nouvelle génération), ont ouvert de nouvelles opportunités qui permettent la caractérisation complète des gènes HLA de façon haploïde. Le NGS possède deux caractéristiques distinctes, la première étant le séquençage clonal des fragments d'ADN et la seconde, un débit extrêmement élevé. Le NGS donne la capacité de phaser les polymorphismes et donc d'éliminer toutes les ambiguïtés, et de fournir un typage HLA à des niveaux de 3 à 4 décimales sans recourir à des tests de contrôle. Par conséquent, il apporte une solution potentiellement complète à la problématique du typage HLA. Le protocole décrit ici bénéficie de cette technologie et combine l'amplification de la PCR à longue portée des gènes HLA avec le séquençage sur la plateforme Illumina MiSeq. Plus spécifiquement, les gènes HLA A, B, C, DPA1, DQA1 et DQB1 sont amplifiés sur la totalité de leur longueur de codage, y compris les éléments des régions non traduites des extrémités 5’ et 3’, tandis que les gènes DRB1, DRB3 et DRB4 sont amplifiés de l'intron 1 à l'intron 4 et que les gènes DRB5 et DPB1 sont amplifiés de l'intron 1 à la région non traduite 3’. Les amplicons sont ensuite traités selon la procédure suivante : 1. Fragmentation des amplicons à une taille appropriée pour le séquençage sur la plateforme Illumina. 2. Réparation et adénylation des extrémités des amplicons fragmentés. 3. Ligation des séquences d'adaptateurs utilisées durant le processus sur le séquenceur MiSeq pour capturer, amplifier et séquencer l'ADN. Les adaptateurs incluent également un index qui est une courte séquence, univoque de chaque adaptateur, permettant d'identifier les origines de la banque (échantillon/locus). Après mise en commun des banques indexées, sélection des tailles et quantification, l'échantillon est chargé sur le séquenceur MiSeq pour séquençage. L'ensemble du processus prend de 3 à 5 jours, en fonction de la sélection de la cellule de débit sur la plateforme Illumina. Un résumé des étapes du protocole est illustré dans le diagramme ci-dessous :

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Résumé des étapes

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Glossaire/Définitions § Plaque d'amplicons – Autre nom pour Plaque d'amplification § Plaque de quantification d'amplicons – Plaque à 96 puits compatible avec le fluoromètre de plaque où les amplicons dilués sont quantifiés § Plaque d'amplification – Plaque de PCR à 96 puits utilisée pour amplifier le loci HLA § Banque finale – Banque qui inclut toutes les banques d'échantillons prêtes à être séquencées en une seule exécution du séquenceur MiSeq § Plaque de réactions – Plaque sur laquelle ont lieu les réactions séquentielles de fragmentation, réparation des extrémités et ligation des adaptateurs indexés à la banque d'échantillons § Plaque de réactifs – Plaque utilisée pour aliquoter les différents réactifs servant à la préparation des banques § Banque d'échantillons – Banque préparée en combinant (regroupant) tous les loci HLA d'un échantillon donné § Plaque d'amplicons regroupés – Plaque contenant une banque d'échantillons (tous locis combinés) par puits § Plaque de quantification d'étalons – Plaque à 96 puits compatible avec le fluoromètre de plaque où les étalons d'ADN sont placés en vue de la quantification des amplicons

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Étape 1 – Préparation du mélange de référence pour l'amplification HLA Durée : ~2 heures L'objectif de cette étape est de préparer des mélanges de référence par locus, afin d'amplifier chaque locus HLA ciblé individuellement. Les loci amplifiés par ce protocole sont HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 et HLA-DQB1. Remarque : Les mélanges de référence préparés à cette étape incluent tous les réactifs nécessaires à l'amplification, excepté le Taq polymérase.

Liste des réactifs Article Mélange d'amorces HLA-A Mélange d'amorces HLA-B Mélange d'amorces HLA-C Mélange d'amorces HLA-DRB1/DRB3 Mélange d'amorces HLA-DRB4 Mélange d'amorces HLA-DRB5 Mélange d'amorces HLA-DPA1 Mélange d'amorces HLA-DPB1 Mélange d'amorces HLA-DQA1 Mélange d'amorces HLA-DQB1 (Set 3) Amplificateur 1 Amplificateur 2 Tampon pour PCR de longue portée (10×) dNTP (10 mM chacun) H2O de qualité moléculaire

Stockage -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C

Fourni par Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Qiagen Qiagen Qiagen

Protocole 1.1 – Sortir tous les mélanges d'amorces, les amplificateurs 1 et 2, les dNTP et le tampon pour PCR à longue portée (10×) de leur lieu de stockage et les décongeler à température ambiante. 1.2 – Préparer la combinaison d'amplificateurs : ajouter 132 µl d'amplificateur 2 dans le tube d'amplificateur 1. Remplacer l'étiquette Amplificateur 1 par une étiquette Amplificateur combiné. Enregistrer l'amplificateur 2 restant à utiliser dans la réaction de PCR à longue portée de DRB4.

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1.3 – Préparer un mélange de référence pour chaque mélange d'amorces conformément aux tableaux ci-dessous :

Mélange de référence : HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 et DQA1 Réactif Mélange d'amorces Tampon pour PCR de longue portée (10×) Mélange dNTP (10 mM chacun) H2O de qualité moléculaire Volume total

Volume/échantillon/ locus 2 µl 2,5 µl 1,25 µl 13,85 µl 19,6 µl

Volume/ 96 échantillons/locus 204 µl 255 µl 127,5 µl 1412,7 µl 1999,2 µl

Volume/échantillon/ locus 2 µl 2,5 µl 1,25 µl 0,6 µl 13,25 µl 19,6 µl

Volume/ 96 échantillons/locus 204 µl 255 µl 127,5 µl 61,2 µl 1351,5 µl 1999,2 µl

Volume/échantillon/ locus 2 µl 2,5 µl 1,25 µl 5,6 µl 7,85 µl 19,2 µl

Volume/ 96 échantillons/locus 204 µl 255 µl 127,5 µl 571,2 µl 800,7 µl 1958,4 µl

Mélange de référence : HLA-DRB4 Réactif Mélange d'amorces Tampon pour PCR de longue portée (10×) Mélange dNTP (10 mM chacun) Amplificateur 2 H2O de qualité moléculaire Volume total

Mélange de référence : HLA-DQB1 Set 3 Réactif Mélange d'amorces Tampon pour PCR de longue portée (10×) Mélange dNTP (10 mM chacun) Amplificateur combiné H2O de qualité moléculaire Volume total

1.4 – Mélanger au vortex chaque mélange de référence et les centrifuger pendant 1 seconde. Les placer sur de la glace. 1.5 – Diluer tous les ADN génomiques à une concentration de 30 ng/µl (volume minimal : 55 µl).



Remarque : Le Holotype HLA contient suffisamment de réactifs pour 96 réactions et un volume supplémentaire pour tenir compte des pertes dues au pipetage et aux échecs d'amplification.

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Étape 2 – Amplification des HLA de classe I et II Durée : ~8 heures 10 minutes L'objectif de l'étape 2 est d'amplifier les loci HLA. Les conditions d’amplification des HLA de classe I et II ont été optimisées à l'aide de deux programmes de PCR distincts. Une fois les réactions de la PCR terminées, l’amplification est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose (facultatif).



Conseil rapide : l'électrophorèse sur gel d’agarose (étape 2.5), bien que recommandée, n'est pas requise pour parfaitement exécuter le protocole Holotype HLA. Lorsque les amplicons sont quantifiés (Étape 3), toute concentration supérieure à 50 ng/µl est considérée comme une amplification réussie. L'électrophorèse sur gel d’agarose est une étape importante de contrôle de la qualité et ne doit pas être ignorée par un utilisateur qui n'aurait pas une expérience suffisante du protocole Holotype HLA entier.

Liste des réactifs Article Mélange de référence HLA-A Mélange de référence HLA-B Mélange de référence HLA-C Mélange de référence HLA-DRB1/DRB3 Mélange de référence HLA-DRB4 Mélange de référence HLA-DRB5 Mélange de référence HLA-DPA1 Mélange de référence HLA-DPB1 Mélange de référence HLA-DQA1 Mélange de référence HLA-DQB1 (Set 3) Taq polymérase gADN H2O de qualité moléculaire

Stockage -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C 4 °C 20 °C

Fourni par Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Qiagen Utilisateur Utilisateur

Protocole 2.1 – Sortir le Taq polymérase de son lieu de stockage, le centrifuger brièvement, puis l'ajouter à chaque mélange de référence conformément aux tableaux ci-dessous, en rinçant les pointes de pipette soigneusement à chaque pipetage :

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Mélange de référence chargé de Taq polymérase : HLA-A, B, C, DRB1/3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 et DQA1 Réactif Mélange de référence de l'étape 1 Taq polymérase Total

Volume/échantillon/ locus 19,6 µl 0,4 µl 20 µl

Volume/ 96 échantillons/locus 1999,2 µl 40,8 µl 2040 µl

Mélange de référence chargé de Taq polymérase : HLA-DQB1 Set 3 Réactif Mélange de référence de l'étape 1 Taq polymérase Total

Volume/échantillon/ locus 19,2 µl 0,8 µl 20 µl

Volume/ 96 échantillons/locus 1958,4 µl 81,6 µl 2040 µl

2.2 – Mélanger au vortex puis centrifuger brièvement tous les mélanges de référence chargés en Taq polymérase. Aliquoter 20 µl de chaque mélange de référence chargé en Taq polymérase dans des puits séparés de plaques de PCR à 96 puits.



Remarque : Les amplifications de classe I et II ont été optimisées à l'aide de deux programmes de PCR distincts. Par conséquent, les mélanges de référence de classe I et II ne doivent pas être placés dans la même plaque.

2.3 – Ajouter 5 µl de chaque échantillon d'ADN génomique dilué dans les puits correspondants des plaques préparées à l’étape précédente. Mélanger par pipetage. Sceller les puits avec du film de scellage thermique et inspecter visuellement chaque puits. Centrifuger brièvement toutes les plaques d’amplification. 2.4 – Placer les plaques d’amplification dans des thermocycleurs et exécuter les programmes d’amplification de classe I et II conformément aux tableaux ci-dessous :

Amplification de classe I (HLA-A, B et C) Nombre de cycles 1 35 1 1

Température 95 °C 95 °C 65 °C 68 °C 68 °C 4 °C

Temps 3 minutes 15 secondes 30 secondes 5 minutes 10 minutes ∞

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Amplification de classe II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 et DQB1) Nombre de cycles 1 35 1 1

Température 95 °C 93 °C 60 °C 68 °C 68 °C 4 °C

Temps 3 minutes 15 secondes 30 secondes 9 minutes 10 minutes ∞





Remarque : La réussite de l’amplification peut être vérifiée en exécutant 2 µl de chaque amplicon sur du gel d’agarose à 2 % standard, à 250 V pendant 30 minutes. (Facultatif)

Tailles attendues des amplicons Locus HLA HLA-A, B et C HLA-DRB1/DRB3 HLA-DRB4 HLA-DRB5 HLA-DPA1 HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB (Set 3)

Taille attendue des amplicons (kb) ~3 ~4,3 ~4,2 ~4,2 ~5,7 ~6,7 ~6 ~6,6



Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risque d'altération à 4 °C jusqu'au lendemain ou à -20 °C pour une durée prolongée.

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Étape 3 – Quantification et normalisation des amplicons (à l'aide d'un fluoromètre de plaque) Durée : ~2 heures La quantification et la normalisation des amplicons sont recommandées afin d'assurer une entrée précise dans l'étape de préparation de banque (facultatif). La concentration des amplicons est mesurée avec le système QuantiFluor dsDNA qui contient un marqueur fluorescent se fixant sur l’ADN et un étalon ADN permettant une quantification précise de petites quantités d’ADN double brin. (dsADN). Se référer à l’annexe 2 pour des instructions de quantification des amplicons sur un appareil qPCR.



Conseil rapide : la quantification des amplicons, bien que recommandée, n'est pas requise pour parfaitement exécuter le protocole Holotype HLA. La normalisation des amplicons ne requiert pas une mesure précise de la concentration des amplicons. En guise d'alternative, une estimation de la concentration des amplicons fondée sur l'expérience ou une électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée. La quantification des amplicons ne doit pas être ignorée par un utilisateur qui n'aurait pas une solide expérience du protocole Holotype HLA entier.

Liste des réactifs Article Plaque d'amplification de classe I Plaque d'amplification de classe II Étalon ADN Lambda (100 ng/µl) Marqueur couleur QuantiFluor dsDNA (200×) Tampon TE 20× (pH 7,5) H2O de qualité moléculaire ExoSAP-iT Express

Stockage 4 °C 4 °C 4 °C 4 °C 4 °C 20 à 25 °C -20 °C

Fourni par Étape 2 Étape 2 Promega Promega Promega Utilisateur Affymetrix

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Protocole 3.1 – Préparer des étalons d’ADN par dilution sérielle de l’étalon ADN Lambda QuantiFluor (100 ng/µl) fourni dans le kit QuantiFlor, conformément au tableau de dilution ci-dessous : Libellé du tube Étalon 1 Étalon 2 Étalon 3 Étalon 4 Étalon 5 Étalon 6 Vierge

ADN utilisé ADN Lambda Étalon 1 Étalon 2 Étalon 3 Étalon 4 Étalon 5 Vierge

Volume d'ADN (µl) 7,5 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 0 µl

Volume TE 1x (µl) 492,5 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl

Conc. finale (ng/µl) 1,5 ng/µl 0,75 ng/µl 0,38 ng/µl 0,19 ng/µl 0,09 ng/µl 0,05 ng/µl 0 ng/µl

3.2 – Préparer les plaques de quantification des amplicons (voir les figures supplémentaires). Aliquoter 99 µl de tampon TE 1x TE dans les puits d'une plaque optique à 96 puits pour le nombre total d'amplicons à quantifier. 3.3 – Ajouter 1 µl des amplicons des puits correspondants des plaques d'amplification dans les puits individuels des plaques de quantification des amplicons. Mélanger par pipetage. 3.4 – Préparer une solution de travail avec le marqueur couleur 1× QuantiFluor Dye selon la formule suivante : 0,5 µl de marqueur couleur QuantiFluor Dye (200X) + 99,5 µl de tampon TE 1×. Préparer une quantité suffisante de solution de travail de marqueur couleur 1× QuantiFluor Dye de sorte que chaque échantillon (totalité des échantillons dans les plaques d'amplification) et chaque étalon (14 au total) reçoive un aliquote de 100 µl. 3.5 – Préparer une plaque de quantification des étalons et des plaques de quantification des amplicons. Aliquoter 100 µl de solution de travail de marqueur couleur 1× QuantiFluor Dye dans les puits de la plaque optique à 96 puits, qui sera la plaque de quantification des étalons, et des plaques de quantification des amplicons préparées à l'étape 3.2. 3.6 – Utiliser les étalons préparés ci-dessus et ajouter 100 µl de chaque étalon, en double exemplaire, dans les puits individuels de la plaque de quantification des étalons (14 puits au total). Mélanger par pipetage. 3.7 – Mélanger au vortex et centrifuger brièvement. 3.8 – Effectuer un passage de la plaque de quantification des étalons dans le fluoromètre, suivi d'un passage des plaques de quantification d’amplicons. 3.9 – Calculer la concentration de l'ADN dans les plaques de quantification d’amplicons en utilisant les données de RFU (Relative fluorescence units, Unités de fluorescence relative) générées par le fluoromètre de plaque. Pour une assistance en matière de calculs, se référer à l'onglet Dilution du classeur Excel fourni.

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3.10 – Diluer l’ADN dans les plaques d’amplification avec de l’eau de qualité moléculaire pour que la concentration finale de l’ADN soit de 67 ng/µl environ. § Si la concentration de l'ADN est égale ou supérieure à 150 ng/µl, ajouter 25 µl d'eau. § Si la concentration de l'ADN est comprise entre 100 et 150 ng/µl, ajouter 10 µl d'eau. § Si la concentration de l'ADN est inférieure à 100 ng/µl, ne pas ajouter d'eau.

Regroupement des amplicons 3.11 – Regrouper tous les loci de chaque échantillon dans une seule plaque d'amplicons regroupés. Combiner les volumes indiqués de chaque locus comme dans le tableau cidessous pour obtenir un volume final de 35 µl : Locus HLA A B C DRB1/DRB3 DRB4 DRB5 DPA1 DPB1 DQA1 DQB1 Set 3

Volume regroupé 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl 3,5 µl

3.12 – Ajouter 4 µl d'ExoSAP-iT Express dans chaque banque d'échantillons. Rincer les pointes de pipette après chaque pipetage. Sceller la plaque avec du film de scellage thermique et centrifuger brièvement. 3.13 – Placer la plaque d'amplicons regroupés dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant :

Purification des produits de PCR avec ExoSAP-IT Express Nombre de cycles 1 1 1

Température 37 °C 80 °C 4 °C

Temps 4 minutes 1 minute ∞



Point d'arrêt sans altération. Les amplicons peuvent être stockés sans risque d'altération à 4 °C jusqu'au lendemain ou à -20 °C pour une durée prolongée.

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Étape 4 – Préparation des banques Durée : ~3 heures Au cours de cette étape, les amplicons regroupés sont préparés pour le séquençage sur le séquenceur Illumina MiSeq. Les amplicons sont fragmentés par une réaction enzymatique, les extrémités sont réparées et adénylatées, et les adaptateurs indexés sont ligaturés aux extrémités. Une mise en commun des banques est ensuite effectuée, suivie d'un seul nettoyage et d'une étape de concentration à l'aide de billes AMPure XP.



Remarque : Omixon recommande des volumes plus importants que nécessaire pour 96 échantillons car bon nombre d'enzymes et de tampons sont visqueux, ce qui peut entraîner une perte excessive lors du pipetage.

Liste des réactifs Article Plaque d'amplicons regroupés Enzyme de fragmentation (A) Tampon de fragmentation (B) Enzyme de réparation des extrémités (C) Tampon de réparation des extrémités (D) Enzyme de ligation (E) Tampon de ligation (F) Plaque d'adaptateurs Billes AMPure XP Éthanol à 80 % (fraîchement préparé) H2O de qualité moléculaire

Stockage 4 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C 4 °C 20 à 25 °C 20 à 25 °C

Fourni par Étape 3 Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Beckman Coulter Utilisateur Utilisateur

Protocole 4.1 – Mettre en marche le thermocycleur. Vérifier que le couvercle chauffant est en cours de chauffe.



Remarque : Veiller à mélanger vigoureusement au vortex l’enzyme de fragmentation (A) avant utilisation.

4.2 – Préparer le mélange de référence de fragmentation conformément au tableau cidessous :

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Mélange de référence de fragmentation Réactif Enzyme de fragmentation (A) Tampon de fragmentation (B) Volume total

Volume par banque (µl) 2 µl 2 µl 4 µl

Volumes recommandés pour 96 banques (µl) 220,8 µl 220,8 µl 441,6 µl

Code couleur Jaune Rouge

4.3 – Préparer une plaque de réactifs : placer une nouvelle plaque pour PCR à 96 puits sur un portoir de refroidissement de PCR et aliquoter une quantité égale de mélange de référence de fragmentation dans chaque puits d'une seule colonne.



Remarque : La réaction de fragmentation a été conçue de sorte que l’ADN obtenu soit de la taille idéale pour le séquençage sur le système Illumina MiSeq. Il est important de maintenir les réactifs au frais jusqu’au démarrage de la réaction dans le thermocycleur afin d'éviter une fragmentation excessive. Il est recommandé d’utiliser des pipettes multicanal pour minimiser le risque de fragmentation excessive.

4.4 – Centrifuger la plaque d'amplicons regroupés pendant 10 secondes, puis placez-la sur de la glace ou un cryopack. 4.5 – Préparer une plaque de réactions : placer une nouvelle plaque de PCR à 96 puits sur un portoir de refroidissement de PCR. 4.6 – Ajouter 4 µl de mélange de référence de fragmentation de la plaque de réactifs dans les puits de la plaque de réactions, correspondant aux échantillons de la plaque d'amplicons regroupés. Il est recommandé d’utiliser des pipettes multicanal. 4.7 – Transférer 16 µl de chaque amplicon de la plaque d'amplicons regroupés dans les puits correspondants de la plaque de réactions à l'aide d'une pipette multicanal. Mélanger par pipetage. 4.8 – Sceller la plaque de réactions avec du film de scellage thermique et centrifuger pendant 10 secondes. 4.9 – Incuber la plaque de réactions dans un thermocycleur avec le programme suivant :

Programme de fragmentation Nombre de cycles 1 1 1

Température 37 °C 70 °C 4 °C

Temps 10 minutes 15 minutes ∞



Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risque d'altération à 4 °C jusqu'au lendemain ou à -20 °C pour une durée prolongée.

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4.10 – Préparer le mélange de référence de réparation des extrémités conformément au tableau ci-dessous :

Mélange de référence de réparation des extrémités Volume par Volumes recommandés banque (µl) pour 96 banques (µl) H2O de qualité moléculaire 1,25 µl 139,2 µl Enzyme de réparation des extrémités (C) 1,25 µl 139,2 µl Tampon de réparation des extrémités (D) 2,5 µl 278,4 µl Volume total 5 µl µl Réactif

Code couleur Vert Orange

4.11 – Aliquoter une quantité égale de mélange de référence dans une seule colonne vide de la plaque de réactifs. 4.12 – Centrifuger la plaque de réactions (contenant les échantillons fragmentés) pendant 10 secondes. Ajouter 5 µl de mélange de référence de réparation des extrémités de la plaque de réactifs dans chaque puits de la plaque de réactions. Il est recommandé d’utiliser des pipettes multicanal. Mélanger par pipetage. 4.13 – Sceller la plaque de réactions avec du film de scellage thermique et centrifuger pendant 10 secondes. 4.14 – Incuber la plaque de réactions dans un thermocycleur avec le programme suivant :

Programme de réparation des extrémités Nombre de cycles 1 1 1

Température 20 °C 70 °C 4 °C

Temps 30 minutes 5 minutes ∞



Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risque d'altération à 4 °C jusqu'au lendemain ou à -20 °C pour une durée prolongée.

4.15 – Sortir la plaque d'adaptateurs indexés de son lieu de stockage et la laisser décongeler à température ambiante après le démarrage du programme de réparation des extrémités dans le thermocycleur. Lorsque la plaque d'aptateurs est à température ambiante, la centrifuger pendant 3 minutes à 3000 tr/min. 4.16 – Retirer délicatement le film de scellage de la plaque d'adaptateurs. Après le retrait du film de scellage, ne pas agiter la plaque d'adaptateurs afin d’éviter tout risque de contamination croisée. 4.17 – Transférer le volume complet de chaque puits depuis la plaque de réactions (25 µl) vers les puits correspondants de la plaque d'adaptateurs. Omixon Holotype 96/11 – CONFIGURATION | Configuration A et CE et Configuration B et CE | Mode d'emploi, version 1. Réservé à un usage diagnostique in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel et exclusif. Page 29 │ 49





Remarque : Si la totalité de la plaque d'adaptateurs ne sera PAS utilisée, il est possible d’utiliser uniquement le nombre nécessaire d'adaptateurs. Couper le film de scellage de la plaque entre les puits à utiliser et les puits à garder. Retirer délicatement le film de scellage de la plaque d'adaptateurs, laissant le film en place au-dessus des puits à garder. a. Transférer 25 µl de chaque échantillon de la plaque de réactions vers un puits non utilisé de la plaque d'adaptateurs, en mélangeant bien à l’aide d’une pipette.



b. Transférer la totalité de chaque échantillon de la plaque d'adaptateurs vers le puits original de la plaque de réactions. c. Sceller de nouveau la plaque d'adaptateurs et la remettre au congélateur (-20 °C). Utiliser la plaque de réactions au lieu de la plaque d'adaptateurs pour les étapes restantes décrites dans le manuel.

4.18 – Préparer le mélange de référence de ligation. Préparer suffisamment de mélange de référence de ligation pour chaque échantillon.

Mélange de référence de ligation Réactif

Volume (µl)

Enzyme de ligation (E) Tampon de ligation (F) Volume total

2,5 µl 30 µl 32,5

Volumes recommandés pour 96 banques (µl) 252,5 µl 3030 µl 3282,5 µl

Code couleur Bleu Noir

4.19 – Aliquoter le mélange de référence de ligation dans 3 colonnes inutilisées de la plaque des réactifs. Il est recommandé d’utiliser des pipettes multicanal. 4.20 – Ajouter 32,5 µl de mélange de référence de ligation dans chaque puits de la plaque de réactions. Il est recommandé d’utiliser des pipettes multicanal. Mélanger par pipetage. 4.21 – Sceller la plaque de réactions avec du film de scellage thermique et centrifuger pendant 10 secondes. 4.22 – Incuber la plaque de réactions dans le thermocycleur avec le programme suivant :

Programme de ligation Nombre de cycles 1 1 1

Température 25 °C 70 °C 4 °C

Temps 10 minutes 10 minutes ∞



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Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risque d'altération à 4 °C jusqu'au lendemain ou à -20 °C pour une durée prolongée.

Regroupement et purification des banques 4.23 – Laisser les billes AMPure XP atteindre la température ambiante. Veiller à ce qu'elles soient homogènes (dénuées d'amas ou de grappes). Préparer 5 ml d'éthanol à 80 % fraîchement préparé (4 ml EtOH + 1 ml H2O). 4.24 – Créer la banque en combinant un aliquote de chaque amplicon regroupé (une banque par échantillon spécifique) dans un seul tube de microcentrifugation à liaison faible de 2,0 ml. I.

Pour 16 échantillons ou plus – Calculer la quantité de chaque banque d'échantillons à mettre en commun pour obtenir une seule banque d'un volume total de 900 µl. Diviser 900 µl par le nombre de banques d'échantillons. Le résultat est le volume de l'aliquote à prélever de chaque banque d'échantillons et à pipeter dans la banque finale. Pour moins de 16 échantillons – Transférer 60 µl de chaque banque d'échantillons dans une banque.

II.

4.25 – Ajouter 900 µl de billes AMPure XP dans le tube de la banque. Mélanger vigoureusement au vortex, puis centrifuger brièvement. Veiller à ce que les billes ne se séparent pas. Laisser incuber la banque pendant 10 minutes à température ambiante.



Remarque : Si le volume de la banque finale est inférieur à 900 µl, ajouter un volume équivalent de billes AMPure XP. Le rapport entre la banque finale et les billes doit être de 1:1.

4.26 – Placer le tube de la banque finale sur le support magnétique et laisser incuber pendant 10 minutes. 4.27 – Tout en laissant le tube sur le support magnétique, retirer délicatement et éliminer le surnageant du tube de la banque, sans toucher les billes. 4.28 – Tout en laissant le tube sur le support magnétique, ajouter 1,5 à 2 ml d'éthanol à 80 % fraîchement préparé dans le tube de la banque. Le volume d’éthanol ajouté doit être suffisant pour recouvrir les billes. Remarque : Appliquer l’éthanol sur le côté du tube dénué de billes. 4.29 – Laisser incuber la banque à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirer délicatement le surnageant et l'éliminer. 4.30 – Répéter les étapes 4.28 et 4.29.

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4.31 – Centrifuger rapidement le tube de la banque, puis le remettre sur le support magnétique en le laissant ouvert. Retirer l’éthanol résiduel à l’aide d’une pipette sans toucher les billes.



Remarque : S'assurer que le culot de billes ne contient pas d’éthanol résiduel. Il peut s'avérer nécessaire de faire pivoter le tube sur le support magnétique pour enlever l’éthanol sans perturber le culot de billes.

4.32 – Laisser sécher les billes à l’air libre pendant 5 à 8 minutes sur le support magnétique, jusqu’à ce que le culot de billes soit sec. 4.33 – Retirer le tube de la banque du support magnétique et éluer la banque en versant 31 µl d’eau de qualité moléculaire. La pointe de la pipette ne doit pas toucher les billes car cellesci risqueraient d’y adhérer. 4.34 – Mélanger la banque au vortex pour remettre les billes en suspension. Si quelques gouttes restent sur les parois latérales, centrifuger brièvement. Veiller à ce que les billes restent en suspension. 4.35 – Incuber la banque à température ambiante pendant 2 minutes. 4.36 – Placer le tube de la banque sur le support magnétique pendant 2 minutes. 4.37 – Collecter la banque : tout en maintenant la banque finale dans le support magnétique, collecter 31 µl du surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml.



Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risque d'altération à -20 °C pour une durée prolongée.

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Étape 5 – Sélection de la taille des fragments de la banque Durée : ~1 heure L'étape 5 consiste à utiliser la banque collectée à l'étape 4 pour effectuer une sélection de taille des fragments qu'elle contient à l'aide du sélecteur automatisé Pippin Prep. Le Pippin Prep sélectionne automatiquement une plage de tailles des fragments d'ADN et procède à leur élution dans une chambre de collecte. Remarque : Un sélecteur automatisé Blue Pippin peut être utilisé à la place du Pippin Prep. Se référer à l'annexe 1 pour des instructions d’utilisation du sélecteur automatisé Pippin Prep.

Liste des réactifs Article Cassette de gel d'agarose à 1,5 %, sans colorant Mélange de marqueur/solution de charge Pippin (libellé K) Banque regroupée

Stockage 20 à 25 °C 4 °C 4 °C

Fourni par Sage Science Sage Science Étape 4



Remarque : Le Pippin Prep utilise du marqueur K, tandis que le Blue Pippin utilise du marqueur R2.

Protocole 5.1 – Laisser la solution de charge de marqueur K atteindre la température ambiante. 5.2 – Combiner 31 µl du regroupement avec 10 µl de solution de charge de marqueur K. 5.3 – Mélanger au vortex et centrifuger brièvement. 5.4 – Configurer le Pippin Prep pour une collecte des fragments d'ADN compris entre 650 et 1300 pb. Charger l'échantillon de 40 µl sur le port d'accès des échantillons et l'exécuter. Le temps d'exécution est de 45 à 50 minutes. 5.5 – Collecter tout le contenu (approximativement 40 µl) dans la chambre de collecte du Pippin Prep et le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Le contenu est la banque de tailles sélectionnées.



Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risque d'altération à -20 °C pour une durée prolongée.

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Étape 6 – Quantification de la banque au moyen de l'appareil qPCR Durée : ~1 heure 15 minutes Il est nécessaire de quantifier la banque de tailles sélectionnées afin d’obtenir un résultat optimal sur le séquenceur Illumina MiSeq. L'appareil qPCR permet d’en mesurer la concentration avec précision. Pour mesurer la concentration de la banque, vous pouvez également utiliser le kit Qubit dsDNA BR et un fluoromètre Qubit. Pour suivre ce protocole, consultez l'annexe 3.

Liste des réactifs Article Prémélange d'amorces Illumina 10× Mélange de référence KAPA SYBR FAST qPCR 2× Std 1 (20,00 pM) Std 2 (2,00 pM) Std 3 (0,20 pM) Std 4 (0,02 pM) Étalons ADN Illumina H2O de qualité moléculaire Tampon TE 1× (pH 8,0) Banque de tailles sélectionnées

Stockage -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C 20 à 25 °C 20 à 25 °C 4 °C

Fourni par KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems Utilisateur Utilisateur Étape 5

Protocole 1

– Préparer le mélange d'amorces qPCR à l'aide du prémélange d'amorces Illumina 10× et du mélange de référence KAPA SYBR FAST qPCR 2× :



Remarque : Les réactifs du kit KAPA SYBR FAST qPCR (mélange de référence qPCR, prémélange d'amorces et solutions ROX) sont combinés lors de la première utilisation du kit. Ce combiné est stable pendant un minimum de 30 cycles de congélation/décongélation. Suivez la documentation KAPA pour déterminer si la solution ROX est recommandée pour votre appareil de qPCR.

Mélange d'amorces qPCR Réactif Prémélange d'amorces Illumina 10× Mélange de référence KAPA SYBR FAST qPCR 2× Volume total

Volume (ml) 1 ml 5 ml 6 ml

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2

– Préparer le mélange de référence qPCR.

Mélange de référence qPCR Réactif Mélange d'amorces qPCR H2O de qualité moléculaire Volume total 3

Volume (µl) 228 µl 76 µl 304 µl

– Préparer une dilution sérielle de la banque de tailles sélectionnées. a.

Préparer une dilution à 1:1000 en ajoutant 1 µl de banque de tailles sélectionnées à 999 µl de tampon TE 1× (pH 8,0), en rinçant soigneusement la pointe de la pipette. Mélanger au vortex et centrifuger brièvement. Préparer une dilution à 1:2000 en ajoutant 100 µl de la dilution à 1:1000 à 100 µl de tampon TE 1× (pH 8,0). Mélanger au vortex et centrifuger brièvement.

b. 4

– Préparer une plaque de quantification qPCR dans une nouvelle plaque PCR compatible avec votre système qPCR.

5

– Aliquoter 16 µl du mélange de référence qPCR en triple exemplaire pour les étalons 1 à 4, la dilution à 1:1000 et la dilution à 1:2000 (voir les figures complémentaires).

6

– Aliquoter 4 µl des étalons 1 à 4, la dilution à 1:1000 et la dilution à 1:2000 dans les puits correspondants.

7

– Couvrir hermétiquement la plaque de quantification qPCR et la centrifuger pendant 10 secondes.

8

Remarque : Éviter la formation de bulles dans les puits de la plaque de quantification qPCR. Le cas échéant, centrifuger comme nécessaire pour éliminer les bulles.

Définir les triples dilutions à 1:1000 et 1:2000 comme échantillons ciblés, et définir les étalons (points : 4, concentration initiale : 20 pM, dilution : 1:10). Exécuter le programme suivant sur l'appareil qPCR de façon à déterminer la concentration en ADN de la banque de tailles sélectionnées :

Nombre de cycles 1 25 (pas de courbe de fluidité) 9

Température 95 °C 95 °C 60 °C

Temps 5 minutes 30 secondes 90 secondes (acquisition des données)

– Pour convertir le résultat qPCR de concentration de pM à nM, entrer les résultats de la moyenne quantitative des deux réplicats de banque dans l'onglet du classeur Omixon intitulé « Quantification des banques ».

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10

– À partir des volumes indiqués dans le classeur, diluer 10 µl de la banque de tailles sélectionnées à une concentration de 2 nM avec de l'eau stérile dans un nouveau tube de microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Stocker la banque de tailles sélectionnées restante à -20 °C.



Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risque d'altération à -20 °C pour une durée prolongée. En cas de stockage à long terme, une nouvelle quantification est recommandée avant utilisation sur le séquenceur MiSeq.

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Étape 7 – Séquençage sur le système Illumina MiSeq Durée : ~24 à 40 heures Le système Illumina MiSeq est un instrument automatisé de NGS qui peut séquencer la banque de tailles sélectionnées préparée au cours des étapes précédentes. Un démultiplexage des échantillons indexés est effectué automatiquement au terme de l'exécution du séquençage.



Conseil rapide : vous pouvez utiliser un contrôle PhiX à 1 % comme contrôle supplémentaire de la réaction de séquençage. Pour un complément d'information sur le contrôle PhiX, consultez la documentation Illumina.

Liste des réactifs Article Cassette de réactif HT1 PR2 Cellule de débit MiSeq Banque à 2 nM NaOH 1 N ou 2 N H2O de qualité moléculaire

Stockage -20 °C -20 °C 4 °C 4 °C 4 °C 20 à 25 °C 20 à 25 °C

Fourni par Illumina Illumina Illumina Illumina Étape 6 Utilisateur Utilisateur

Capacité du kit de réactifs MiSeq Kit de réactifs Illumina MiSeq Std 500 Cycle (MS-102-2003)

Std 300 Cycle (MS-102-2002)

Micro 300 Cycle (MS-103-1002)

Nano 500 Cycle (MS-103-1003)

Nano 300 Cycle (MS-103-1001)

Temps Heures

Échantillons 96/7

~39

96

~24

96

~19

28

~28

12

~17

6

Protocole 7.1 – Préparer le séquenceur MiSeq conformément aux protocoles standards Illumina.

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7.2 – Préparer une banque dénaturée à 1 nM : Combiner 10 µl de NaOH à 0,2 N fraîchement préparé avec 10 µl de banque de tailles sélectionnées diluée à 2 nM dans un nouveau tube de microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Mélanger au vortex et centrifuger brièvement. Incuber cette banque dénaturée à 1 nM à température ambiante pendant 5 minutes. 7.3 – Préparer une banque dénaturée à 20 pM : Ajouter 980 µl de HT1 réfrigéré aux 20 µl de la banque dénaturée à 1 nM. Mélanger au vortex et centrifuger brièvement. 7.4 – Préparer une banque dénaturée à 9 pM : Ajouter 550 µl de HT1 réfrigéré et 450 µl de la banque dénaturée à 20 pM dans un nouveau tube de microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Mélanger au vortex et centrifuger brièvement. 7.5 – Transférer 600 µl de la banque dénaturée à 9 pM dans le réservoir des échantillons de charge de la cassette de réactifs MiSeq.

Conseil rapide : il est suggéré d'utiliser le classeur fourni pour créer la fiche d'échantillon requise par le système MiSeq.

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Étape 8 – Analyse des données de séquençage HLA Le séquenceur Illumina MiSeq va traiter la banque regroupée à 9 pM et générer des données de séquençage sous la forme de fichiers .fastq. Veuillez-vous référer au manuel HLA Twin pour une assistance à l'installation correcte du logiciel HLA Twin et des informations en matière d'interprétation de l'analyse du génotypage de vos données de séquençage. Pour la mise en œuvre du protocole automatisé et pour tout problème relatif à l'installation ou à l'analyse des données, contactez [email protected].

Protocole automatisé Paramétrage et configuration informatique 1.

Installez le logiciel HLA Twin Server sur le serveur.

§

Installez le logiciel HLA Twin Client sur un ordinateur client (plusieurs clients HLA Twin peuvent se connecter au serveur). Contactez l'assistance Omixon ([email protected]) pour obtenir des instructions d'installation personnalisée de l'automatisation.

§

Protocole par analyse 1.

Lancer le logiciel HLA Twin Client et se connecter.

2.

Les données ont déjà été traitées ou sont en cours de traitement. Examiner les résultats à l'aide du système Traffic Light dans HLA Twin.

3.

Exporter les résultats du génotypage et/ou les séquences consensus, selon les besoins.

Protocole manuel Serveur Paramétrage et configuration informatique § §

Installez le logiciel HLA Twin Server sur le serveur. Installer le logiciel HLA Twin Client sur un ordinateur client.

Protocole par analyse § § § §

Lancer le logiciel HLA Twin Client et se connecter. Sélectionner les données MiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution du typage Holotype HLA. Une fois le typage Holotype HLA terminé, examiner les résultats à l'aide du système Traffic Light dans HLA Twin. Exporter les résultats du génotypage et/ou les séquences consensus, selon les besoins.

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Protocole manuel Bureau Paramétrage et configuration informatique §

Installer le logiciel HLA Twin Desktop.

Protocole par analyse 6

Lancer le logiciel HLA Twin et se connecter.

7

Sélectionner les données MiSeq au format fastq ou fastq.gz et démarrer l'exécution du typage Holotype HLA.

8

Une fois le typage Holotype HLA terminé, examiner les résultats à l'aide du système Traffic Light dans HLA Twin.

9

Exporter les résultats du génotypage et/ou les séquences consensus, selon les besoins.

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Figures supplémentaires Exemples de plaques d'amplicons, d'amplification, de dilution, de quantification des amplicons (pour un locus individuel) et de réactions



Exemple de plaque de quantification des étalons



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Exemple de plaque qPCR de quantification des banques KAPA



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Annexe 1 : Sélecteur automatisé Pippin Prep Programmation du Pippin Prep 1.

Cliquez sur l'onglet Protocol Editor (Éditeur de protocole), puis sur le bouton « New » (Nouveau).

2.

Cliquez sur l'icône de dossier en regard du champ Cassette et sélectionnez « 1.5%DF Marker K » (Marqueur K 1,5 % sans colorant) pour le Pippin Prep ou « 1.5%DF Marker R2 » (Marqueur R2 1,5 % sans colorant) pour le Blue Pippin.

3.

Dans la bande que vous programmez : a. b. c. d.

Mettez en surbrillance le champ « Range » (Plage). Réglez « Ref Lane » (Bande de référence) pour établir une correspondance avec le numéro de la bande dans laquelle vous travaillez. Réglez le champ « Start* » (Début) sur 650. Réglez le champ « End* » (Fin) sur 1300.

4.

Dans le champ Reference Lane (Bande de référence), sélectionnez la bande dans laquelle vous travaillez.

5.

Cliquez sur le bouton « Save As » (Enregistrer sous) et nommez votre programme.

Utilisation du sélecteur automatisé Pippin Prep 1.

Mettez en marche le Pippin Prep en appuyant sur le bouton d'alimentation à l'arrière de l'appareil.

2.

Inspectez visuellement le Pippin Prep. Vérifiez que les 5 témoins lumineux DEL sont allumés et que l'intérieur de l'appareil est propre et sec.

3.

Cliquez sur le logo Sage Science situé au coin inférieur droit de l'écran. La fenêtre qui s'ouvre vous permet de saisir un mot de passe. Le mot de passe d'usine par défaut est « pips ».

4.

Cliquez sur l'onglet Factory Setup (Paramétrage d'usine) et vérifiez que la valeur Base-toThreshold (Base à Seuil) est réglée sur 0,02.

5.

Placez l'outil d'étalonnage à l'intérieur du Pippin Prep, en veillant à ce que la bande foncée soit orientée vers le bas et placée au-dessus des témoins lumineux DEL.

6.

Dans l'onglet Main (Principal), cliquez sur le bouton « Calibration » (Étalonnage).

7.

Dans la fenêtre Calibration (Étalonnage), vérifiez que le champ « Target I pH mA » (mA pH Cible I) est réglé sur 0,80 (0,60 sur le Blue Pippin), puis appuyez sur le bouton « Calibrate » (Étalonner).

8.

Accédez à l'onglet Protocols (Protocoles). Cliquez sur le bouton « Load » (Charger) et sélectionnez le programme Holotype HLA ainsi que la bande que vous allez utiliser. Vérifiez les points suivants :

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a. b. c. 9.

La bande adéquate est activée. Le témoin de sélection d'un large spectre est activé. La bande de référence est la même que la bande qui sera exécutée.

Accédez à l'onglet Main (Principal). Vérifiez les points suivants : a. b.

Le programme que vous avez chargé est celui qui est sélectionné. La bande de référence appropriée est sélectionnée et c'est aussi la bande dans laquelle l'échantillon sera exécuté.

10. Inspectez la cassette. Avant d'enlever le film de scellage des puits, vérifiez la présence éventuelle de bulles derrière l'accès de la chambre d'élution. Le cas échéant, tapotez et balancez légèrement la cassette entre vos mains pour éliminer les bulles. 11. Placez la cassette, puits toujours scellés, à l'intérieur du Pippin Prep. 12. Retirez délicatement le film de scellage, en prenant soin de le retirer depuis le côté inutilisé de la cassette (bande 5) vers le côté utilisé (bande 1). Veillez à éviter toute éclaboussure de liquide une fois le film retiré pour éviter une éventuelle contamination. 13. Retirez le volume entier de tampon du port d'accès à la chambre d'élution de la bande que vous allez utiliser et ajoutez 40 µl de tampon d'électrophorèse frais dans ce port d'accès. 14. Recouvrez les ports d'accès d'une fine bande de scellage. 15. Tous les réservoirs pleins à moins des 3/4 de leur volume doivent être complétés avec du tampon d'électrophorèse. Néanmoins, les puits ne doivent pas déborder ! Le niveau du tampon doit juste atteindre le plastique du puits pour ne pas déborder lors du glissement du couvercle. Complétez le tampon depuis les puits inutilisés (bande 5) vers les puits utilisés (bande 1). 16. Vérifiez que chacun des puits de charge (puits contenant de l'agarose) sont remplis de tampon d'électrophorèse. Le tampon doit juste recouvrir l'agarose et présenter une surface parfaitement plane. 17. Fermez lentement le Pippin Prep, en veillant à éviter tout contact entre le tampon et le couvercle lorsque vous fermez l'appareil. 18. Effectuez le test de continuité. Il arrive parfois, lorsque les capteurs sèchent légèrement, que le test échoue au premier essai. Le cas échéant, effectuez le test une seconde fois. Une fois le test de continuité terminé, ouvrez lentement le Pippin Prep. Vérifiez que le couvercle de l'appareil ne fait pas couler le liquide dans la cassette. 19. Mélangez la solution de charge de marqueur K au vortex et centrifugez-la brièvement. Ajoutez 10 µl de cette solution aux ~30 µl de la banque. 20. Mélangez la banque au vortex et centrifugez-la brièvement. 21. Retirez 40 µl de tampon du puits d'échantillon que vous allez utiliser. 22. Ajoutez ~40 µl de la banque chargée en marqueur K au puits d'échantillon que vous allez utiliser. Omixon Holotype 96/11 – CONFIGURATION | Configuration A et CE et Configuration B et CE | Mode d'emploi, version 1. Réservé à un usage diagnostique in vitro Copyright© 2017, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel et exclusif. Page 44 │ 49



23. Marquez la bande que vous utilisez en inscrivant les initiales du technicien et la date. 24. Fermez le Pippin Prep et cliquez sur le bouton « Start » (Démarrer). Vérifiez que la bande appropriée a été activée. L'exécution de l'échantillon doit durer 45 minutes environ. 25. Une fois l'exécution terminée, ouvrez prudemment le Pippin Prep. Veillez à ce que le couvercle ne fasse pas couler de liquide dans la cassette. 26. Retirez la bande de scellage des ports d'accès à la chambre d'élution, en évitant soigneusement tout écoulement de liquide. 27. Transférez le volume entier du port d'accès à la chambre d'élution dans un tube à liaison faible de 1,5 ml. 28. Recouvrez tous les puits ouverts à l'aide d'un double film de scellage de plaque. Pensez à laisser une languette de film du côté inutilisé, ce qui facilitera le retrait du film de scellage depuis le côté inutilisé vers le côté utilisé. 29. Placez la cassette scellée dans sa poche et mettez-la de côté. 30. Prenez la cassette de lavage et remplissez-la d'eau MiliQ. Refermez doucement le couvercle du Pippin Prep, en prenant soin d'éviter tout écoulement de liquide dans la cassette de lavage. 32. Laissez le Pippin Prep fermé pendant plusieurs secondes. 33. Ensuite, ouvrez-le en prenant soin d'éviter tout écoulement de liquide dans la cassette de lavage. 34. Retirez la cassette de lavage, videz son contenu en eau et laissez-la sécher. 35. Essuyez toute trace d'eau dans le Pippin Prep et fermez doucement ce dernier. 36. Sélectionnez le bouton « Shut Down » (Fermer) dans le menu Pippin Prep.

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Annexe 2 : Quantification des amplicons au moyen d'un appareil qPCR Durée : 2 heures

Liste des réactifs Article Tampon TE 20× (pH 7,5) Étalon ADN Lambda (100 ng/µl) 200× marqueur couleur QuantiFluor dsDNA H2O stérile Plaque(s) d'amplification de classe I Plaque(s) d'amplification de classe II

Stockage 4 °C 4 °C 4 °C 20 à 25 °C 4 °C 4 °C

Fourni par Promega Promega Promega Utilisateur Étape 2 Étape 2

Protocole 2.

Créer une dilution sérielle en utilisant des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et l'étalon QuantiFluor Lambda DNA (100 ng/µl). Appliquer la table de dilution ci-dessous : Libellé du tube

Étalon 1 Étalon 2 Étalon 3 Étalon 4 Étalon 5 Étalon 6 Standard 7, vierge

ADN utilisé ADN Lambda Étalon 1 Étalon 2 Étalon 3 Étalon 4 Étalon 5 Vierge

Volume d'ADN (µl) 7,5 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 0 µl

Volume TE 1x (µl) 492,5 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl

Conc. finale (ng/µl) 1,5 ng/µl 0,75 ng/µl 0,38 ng/µl 0,19 ng/µl 0,09 ng/µl 0,05 ng/µl 0 ng/µl

3.

Préparer les plaques de quantification des amplicons (voir les figures supplémentaires). Aliquoter 49,5 µl de tampon TE 1x dans les puits d'une nouvelle plaque à 96 puits pour le nombre total d'amplicons à quantifier.

4.

Ajouter 0,5 µl d'amplicons des puits correspondants des plaques d'amplification dans les puits individuels des plaques de quantification des amplicons. Mélanger par pipetage.

5.

Préparer une solution de travail de marqueur couleur QuantiFluor 1× selon la formule suivante : 0,25 µl de marqueur couleur QuantiFluor (200X) + 49,75 µl de tampon TE 1×. Préparer une quantité suffisante de solution de travail de marqueur couleur QuantiFluor 1× de sorte que chaque échantillon (pour le total des échantillons des plaques d'amplification) et chaque étalon (14 au total) reçoive un aliquote de 50 µl.

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6.

Préparer une plaque de quantification des étalons et des plaques de quantification des amplicons. Aliquoter 50 µl de solution de travail de marqueur couleur QuantiFluor 1×dans les puits des plaques optiques à 96 puits selon le format de la plaque de quantification des étalons et des plaques de quantification des amplicons (voir les figures supplémentaires).

7.

À partir des étalons préparés ci-dessus, ajouter 50 µl de chaque étalon, en double exemplaire, dans les puits individuels de la plaque de quantification des étalons (14 puits au total).

8.

Mélanger intégralement au vortex et centrifuger brièvement.

9.

Placer chaque plaque de quantification une par une dans l'appareil de qPCR et exécuter le programme suivant : Nombre de cycles 1 2

Température 25 °C 25 °C 25 °C

Temps 10 secondes 15 secondes 30 secondes (acquisition des données)

10. Calculer la concentration de l'ADN dans les plaques de quantification des amplicons à partir des données brutes des unités de fluorescence relative (RFU) générées par l'appareil de qPCR. 11. Diluer l'ADN dans les plaques d'amplification avec de l'eau stérile de sorte que la concentration finale de l'ADN soit de 67 ng/µl environ. § Si la concentration de l'ADN est égale ou supérieure à 150 ng/µl, ajouter 25 µl d'eau. § Si la concentration de l'ADN est comprise entre 100 et 150 ng/µl, ajouter 10 µl d'eau. § Si la concentration de l'ADN est inférieure à 100 ng/µl : ne pas ajouter d'eau.

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Annexe 3 : Quantification d'une banque utilisant un marqueur couleur fluorescent dsDNA intercalaire Durée : ~15 minutes La concentration de la banque de tailles sélectionnées peut être mesurée avec précision en intercalant un marqueur couleur fluorescent dsDNA tel que le vert SYBR ou un équivalent. Les kits et instruments à cette fin disponibles dans le commerce incluent, sans toutefois s'y limiter, le fluoromètre Qubit de Thermo Fisher (qui utilise le kit de test Qubit Broad-Range dsDNA), le fluoromètre Qantus de Promega (qui utilise le marqueur couleur fluorescent Quantifluor dsDNA). La méthode Qubit est décrite ici car elle est la plus communément utilisée. Si vous utilisez un autre kit et un autre instrument, suivez les instructions habituelles du fabricant.



Remarque : Cette méthode de fluorométrie est un moyen rapide mais précis de déterminer la concentration de la banque de tailles sélectionnées finale. Elle permet de mesurer la totalité du dsADN présent dans la banque.

Liste des réactifs Article Kit de test Qubit dsDNA BR Étalons Qubit dsDNA BR Banque de tailles sélectionnées

Stockage température ambiante 4 °C 4 °C

Fourni par Thermo Fisher Thermo Fisher Étape 5

Protocole 6.1 – Laisser les étalons Qubit atteindre la température ambiante. Préparer des tubes à essai Qubit (500 µl, paroi mince) pour la banque en double exemplaire et les deux étalons. Mélanger au vortex et centrifuger les étalons et la banque. 6.2 – Ajouter 995 µl de tampon et 5 µl de marqueur couleur dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. Mélanger au vortex et centrifuger brièvement. 6.3 – Transférer 190 µl du mélange de réactifs dans les tubes Qubit des deux étalons. Transférer 198 µl du mélange de réactifs dans les tubes Qubit des deux exemplaires de la banque. 6.4 – Ajouter 10 µl de l'étalon 1 dans le tube Qubit correspondant et mélanger au vortex pendant 2 secondes. Procéder de la même façon avec l'étalon 2. 6.5 – Ajouter 2 µl de la banque dans les deux tubes Qubit correspondants et mélanger au vortex pendant 2 secondes. 6.6 – Incuber les tubes Qubit à température ambiante pendant 2 minutes. 6.7 – Mettre en marche l'appareil Qubit et choisir un protocole BR.

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6.8 – Placer le tube Qubit d'étalon 1 dans l'appareil, puis appuyer sur GO. Procéder de la même façon avec l'étalon 2. 6.9 – Placer le tube de la banque dans l'appareil Qubit, puis appuyer sur GO. Procéder de la même façon avec le second exemplaire. 6.10 – Pour convertir le résultat Qubit de concentration de ng/µl à nM, entrer les résultats de concentration moyenne des deux exemplaires de banque dans l'onglet du classeur Omixon intitulé « Quantification des banques ». 6.11 – À partir des résultats de la mesure Qubit, diluer 10 µl de la banque de tailles sélectionnées à une concentration de 2 nM avec de l'eau stérile dans un nouveau tube de microcentrifugation à liaison faible de 1,5 ml. Stocker la banque de tailles sélectionnées restante à -20 °C.



Point d'arrêt sans altération. Les banques peuvent être stockées sans risque d'altération à -20 °C pour une durée prolongée. En cas de stockage à long terme, une nouvelle quantification est recommandée avant utilisation sur le séquenceur MiSeq.



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