HOLOTYPE HLA™ CONFIGURATION 96/7 A & CE et CONFIGURATION 96/7 B & CE (ref : H32 et ref : H34)

GUIDE d’UTILISATION VERSION 9 2017/08/21

DESTINÉ AU 0086

IN

Prépare l’AND à l’analyse par séquençage sur l’Illumina MiSeq

DIAGNOSTIC VITRO



Table des matières Contenu Historique du document– Notes importantes et mises à jour .......................................................................................... 5 Informations sur le fabriquant ......................................................................................................................................... 7 Légende des symboles ..................................................................................................................................................... 7 Holotype HLA-96/7 Configuration 1 &CE : contenus ......................................................................................................... 8 Boîte des amorces (primers) contenues dans le Kit ................................................................................................................................................. 8 Boîte des réactifs de préparation des librairies contenus dans le kit ...................................................................................................................... 8 Plaque d’Adaptateurs à 96 puits .............................................................................................................................................................................. 8 Classeur Excel Workbook ......................................................................................................................................................................................... 9 Logiciel – Omixon HLA Twin ..................................................................................................................................................................................... 9

Transport et stockage ...................................................................................................................................................... 9 Mise en garde et précautions ........................................................................................................................................ 10 Consignes de sécurité .................................................................................................................................................... 10 Paramètres de performance .......................................................................................................................................... 10 Assistance technique ..................................................................................................................................................... 11 Appareils, réactifs et fournitures ................................................................................................................................... 12 Recommandations en Équipement technique ...................................................................................................................................................... 12 Recommandations en matière de réactifs associés ............................................................................................................................................... 12 Fournitures recommandées ................................................................................................................................................................................... 13

Mention Légale ............................................................................................................................................................. 14 Note importante avant de commencer .......................................................................................................................... 15 Recommandation en terme d’isolation d’ADN génomique ................................................................................................................................... 15

Le principe de la méthode ............................................................................................................................................. 15 Résumé des étapes techniques ...................................................................................................................................... 17 Glossaire/Définitions ..................................................................................................................................................... 18 Étape 1 – Amplification HLA et préparation du Master Mix ........................................................................................... 19 Liste de réactifs ...................................................................................................................................................................................................... 19 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 19

Master Mix : HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 et DQA1 ................................................................................ 20 Master Mix: HLA-DQB1 Set 1 (optionnel) et DQB1 Set 2 (requis) ....................................................... 20 Étape 2 – Amplification HLA Classe I et II ....................................................................................................................... 21 Liste de réactifs ...................................................................................................................................................................................................... 21 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 21

Master Mix avec enzyme Taq Polymerase : HLA‐A, B, C, DRB1, DQA1 et DPB1 ................................ 21 Master Mix avec enzyme Taq Polymerase : HLA-DQB1 Set 1 (optionnel) et HLA-DQB1 Set 2 (requis) . 21 Amplification de classe I (HLA-A, B et C) ............................................................................................ 22 Amplification de classe II (HLA-DRB1, DQB1 set 1, DQB1 set 2, DPB1, et DQA1) ................................ 22

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Tailles attendues des Amplicons ....................................................................................................... 22 Étapes 3 – Quantification et normalisation des Amplicons (avec fluoromètre de plaque) .............................................. 23 Liste des réactifs .................................................................................................................................................................................................... 23 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 23

Purification des produits de PCR avec ExoSAP-IT ............................................................................... 25 Étape 4 – Préparation de librairies ................................................................................................................................. 26 Liste de réactifs ...................................................................................................................................................................................................... 26 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 26

Master Mix de fragmentation ........................................................................................................... 26 Programme de fragmentation .......................................................................................................... 27 Master Mix de réparation des extrémités ......................................................................................... 27 Programme de réparation des extrémités ......................................................................................... 28 Master Mix de ligation ..................................................................................................................... 29 Programme de ligation ..................................................................................................................... 29 Étape 5 – Sélection de la taille de librairie ..................................................................................................................... 31 Liste de réactifs ...................................................................................................................................................................................................... 31 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 31

Étape 6 – Quantification de la Librairie .......................................................................................................................... 32 Liste de réactifs ...................................................................................................................................................................................................... 32 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 32

Mix de primer pour la qPCR .............................................................................................................. 32 Master Mix pour la qPCR .................................................................................................................. 33 Étape 7 – Séquençage sur plateforme Illumina MiSeq .................................................................................................... 34 Liste de réactifs ...................................................................................................................................................................................................... 34

Capacité des kits de réactifs MiSeq ................................................................................................... 34 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 34

Étape 8 – Analyse des données du séquençage HLA ....................................................................................................... 36 Protocole pour le lancement automatisé des analyses ......................................................................................................................................... 36

Configuration et paramétrage informatique ..................................................................................... 36 Protocole pour exécuter l’analyse ..................................................................................................... 36 Protocole pour le lancement manuel des analyses avec poste « server » ............................................................................................................ 36

Configuration et paramétrage informatique ..................................................................................... 36 Protocole pour exécuter l’analyse ..................................................................................................... 36 Protocole pour le lancement manuel avec poste « Desktop » (bureau) ............................................................................................................... 37

Configuration et paramétrage informatique ..................................................................................... 37 Protocole pour exécuter l’analyse ..................................................................................................... 37 Figures supplémentaires ................................................................................................................................................ 38 Exemple de plaque pour plaque d’amplicon, plaque d’amplification, plaque de dilution, plaque de quantification d’amplicon (pour locus individuel) et plaque de réactions. ........................................................................................................................................................................ 38 Exemple de plaque de quantification .................................................................................................................................................................... 39 Exemple de plaque qPCR ....................................................................................................................................................................................... 39

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Annexe 1 : Pippin Prep .................................................................................................................................................. 40 Programmer le Pippin Prep .................................................................................................................................................................................... 40 Exécuter le Pippin Prep .......................................................................................................................................................................................... 40

Annexe 2 : Sample Sheet (Feuille de route) .................................................................................................................... 43 Annexe 3 : Quantification d’amplicon avec un instrument de qPCR ............................................................................... 46



Liste de réactifs ...................................................................................................................................................................................................... 46 Protocole ................................................................................................................................................................................................................ 46

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Historique du document– Notes importantes et mises à jour Version V1 V2

Date 5/12/2015 18/01/2016

Auteur

V3

10/02/2016 Robert Pollock

V4

26/02/2016 Robert Pollock

V5

05/04/2016 Robert Pollock

V6

09/04/2016 Efi Melista

V7

23/04/2016 Efi Melista

V8

30/05/2016

Efi Melista

V9

21/08/2017

Efi Melista

Robert Pollock Robert Pollock

Résumé des modifications Première version, ébauche. Deuxième ébauche, corrections mineurs Troisième ébauche, mise à jour des explications des symboles, mise à jour des recommandations de cycles de congélation/décongélation, mise à jour de l’utilisation visée. Quatrième ébauche, mise à jour de la section sur consignes de sécurité Cinquième version, ajout de recommandations alternatives pour la quantification des amplicons Modifié de " enzyme LR- PCR " à " Taq Polymerase " basé sur le changement de documentation de Qiagen DQB1 Set 1 et Set 2 mise à jour de la déclaration Indicateurs de performance mis à jour, Mise à jour des volumes de réactifs de préparation de la librarie Addition de la plaque d’adaptateur configuration B

Autorisé par Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi Gergely Tölgyesi

Gergely Tölgyesi

Efi Melista

Gergely Tolgyesi

Gergely Tolgyesi Gergely Tolgyesi

Gergely Tolgyesi

Avertissement Omixon a entrepris tous les efforts possibles pour que ce guide d’utilisation (GU) soit précis. Omixon décline toute responsabilité en cas d’inexactitudes ou d’omissions. Les informations de ce GU peuvent être modifiées à tout moment sans préavis. Omixon ne peut être tenu pour responsable en cas d’erreur dans le contenu de ce GU. Omixon Holotype HLA 96/7 Configuration A & CE et Configuration B & CE Guide d’Utilisation V9. Copyright© 2016, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel & Propriété d’Omixon

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Omixon se réserve le droit d’apporter des améliorations à ce GU et/ou aux produits qui y sont décrits sans préavis. Si vous remarquez des informations incorrectes, incomplètes ou pouvant être mal interprétées, nous vous serions grés de bien vouloir nous faire part de vos commentaires et suggestions. Merci de les envoyer à [email protected].

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Informations sur le fabriquant Raison sociale : Omixon Biocomputing Ltd Adresse pour les visites : Fehérvári út 50-52/6 Ville : Budapest Code postal : H-117 Pays : Hongrie

Légende des symboles

Numéro de lot Numéro de référence dans le catalogue Consulter le Guide d’Utilisation Contient des réactifs pour un nombre N de tests

Fabricant légal. La date associée à ce symbole fait référence à la date

de fabrication.



Température de stockage recommandée



Date d’expiration



Dispositif médical de Diagnostic in Vitro Contient des composants de remplacement

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Holotype HLA-96/7 Configuration A &CE (Ref: H32) et Configuration B & CE (Ref: H34): contenus Boîte des amorces (primers) contenues dans le Kit

Le coffret des amorces contient des solutions de primer prêt à l’emploi pour la PCR LongRange ciblée des gènes HLA -A, B, C, DPB1, DQA1 et DQB1 ainsi que DRB1. En complément, il contient également deux types d’additifs de PCR (Primer d’amplification 1 et primer d’amplification 2 ou Enhancer 1 et Enhancer 2)

Primer mix HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DRB1 HLA-DQB1 (Set 1) HLA-DQB1 (Set 2) HLA-DQA1 HLA-DPB1 Primer d’amplification 1 DQB Primer d’amplification 2 DQB

n° réf P012 P022 P032 P042 P052 P062 P072 P082 E01 E02

Réactions 96 96 96 96 96 96 96 96 96 96

Vol/tube 220 μl 220 μl 220 μl 220 μl 220 μl 220 μl 220 μl 220 μl 1100 μl 300 μl

# Tubes Code couleur 1 Jaune 1 Rouge 1 Orange 1 Vert 1 Bleu 1 Noir 1 Brun 1 Violet 1 incolore 1 incolore



Boîte des réactifs de préparation des librairies contenus dans le kit

Le coffret de préparation de librairie contient des réactifs pour la préparation de la librairie des amplicon HLA (fragmentation, réparation et adélynation des extrémités des amplicons et ligation des indexes des adaptateurs aux séquences).



Réactif Enzyme de Fragmentation (A) Tampon (Buffer) de Fragmentation (B) Enzyme de Réparation des Extrémités (C) Tampon de Réparation des Extrémités (D) Enzyme de Ligation (E) Tampon (Buffer) de Ligation (F)

N° réf Réactions Vol/tube Tubes Code couleur R11 96 278 μl 1 Jaune R21 96 278 μl 1 Rouge R31 96 162 μl 1 Vert R41 96 324 μl 1 Orange R51 96 324 μl 1 Bleu R61 96 1800 μl 2 Noir



Plaque d’Adaptateurs à 96 puits La plaque d’adaptateur indexé 96 puits contient les indexes NGS (ADN Oligonucléotides double brin) dans une Solution de 5 μl pour générer des librairies de séquençage individuels. La plaque d’adaptateur indexé 96 puits contient suffisamment d’indexes différents pour la production de 96 librairies Omixon Holotype HLA 96/7 Configuration A & CE et Configuration B & CE Guide d’Utilisation V9. Copyright© 2016, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel & Propriété d’Omixon

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individuelles NGS et l’identification des échantillons.

Réactifs Plaque d’adaptateur A (i1-96) Ou Plaque d’adaptateur B (i97-192)

n° réf N1

réactions 96

N2

96

Vol/puits 5 μl 5 μl

# Plaque 1 1



Classeur Excel Workbook Un classeur Excel (workbook) est fourni en support du protocole Holotype HLA 96/7. Il génère la feuille d’échantillon MiSeq (MiSeq sample sheet), facilite les calculs, les agencements de plaque, le suivi, et bien plus encore. Si vous n’en disposez pas encore, merci de contacter [email protected].

Logiciel – Omixon HLA Twin Contactez [email protected] pour les crédits Omixon HLA Twin, associés à l’achat de votre kit Holotype HLA 96/7.

Note importante : Utilisez dans un seul et même workflow les trois composants du kit Holotype HLA 96/7 et le logiciel Omixon HLA Twin, pour constituer un workflow de diagnostic in vitro ! Merci de vous référez à la section Avertissement et Précautions pour connaitre les restrictions d’emploi du produit. Des composants de remplacement sont disponibles sur demande spéciale d’utilisateur. Veuillez de noter qu’Omixon fournit le remplacement de boîtes de composants et non de flacons individuels ! Contacter [email protected] pour plus d’informations.

Transport et stockage

Les kits sont expédiés dans une boîte en polystyrène avec carboglace et doivent être stockés à -20°C à leur arrivée. Merci de vérifier vos contrôles des températures et la procédure de suivi de vos congélateurs. Effectuez leur maintenance régulièrement ! Stockés à -20°C, les kits non-ouverts sont stable jusqu’à leur date d’expiration (inscrite sur l’étiquette du kit). Après ouverture du produit, il est recommandé de ne pas effectuer plus de quatre (4) cycles de congélation/décongélation afin de préserver la stabilité du produit. Les kits ouverts sont stables jusqu’à 3 mois.

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Mise en garde et précautions Restrictions d’utilisation du produit •

• •

• •

Pour une meilleure performance, merci d’utiliser la procédure workflow du kit Holotype HLA 96/7 et le logiciel Omixon HLA Twin pour le typage NGS avec les appareils, équipements et réactifs recommandés dans le paragraphe « Équipements et réactifs ». L’utilisation d’autres appareils que ceux spécifiés dans la section « Équipements et réactifs »doit être vérifiée et validée minutieusement par l’utilisateur ! Ne pas diluer ou reconstituer les réactifs dans d’autres volumes que ceux décrit dans ce GU. Ne pas utiliser moins de volume de réactif que ce qui est décrit dans ce GU. Cela peut induire des erreurs ! Omixon ne peut pas fournir de support pour un quelconque problème résultant d’une déviation des étapes du protocole décrit dans ce GU. Ne pas utiliser le produit en cas de dommage détectable des composants (flacon ou plaque endommagé, bouchon desserré etc…) !



Consignes de sécurité • Lire les paragraphes dédiés aux « consignes de sécurité » et aux « notes importantes » pour chacun des réactifs et des kits mentionnés dans le paragraphe « Appareils, réactifs et fournitures » avant de commencer. • Lors de manipulations de produits chimiques, toujours porter une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection. Pour de plus amples informations, merci de consulter les fiches de données sécurité spécifiques disponibles auprès du fournisseur. • Un récapitulatif des composants chimiques des réactifs du produit se trouve dans les fiches de sécurité du kit Holotype HLA 96/7 disponible sur demande. • Les déchets des composants du produit sont à éliminer comme les autres déchets médicaux.

Paramètres de performance Principaux paramètres de performance, établis d’après la validation de produit.

Sensitivity Specificity Precision Accuracy Reproducibility Repeatability

HLA-A

HLA-B

HLA-DRB1

HLA-C

HLA-DPB1

HLA-DQA1

HLA-DQB1

99.054%

99.171%

98.335%

96.310%

98.818%

98.927%

95.724%

99.966%

99.982%

99.956%

99.863%

99.946%

99.881%

99.775%

99.054%

99.171%

98.335%

96.310%

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95.724%

99.935%

99.965%

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99.736%

99.897%

99.785%

99.572%

100.00%

100.00%

99.28%

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100.00%

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Assistance technique Pour toute demande d’assistance générale concernant ce protocole, contacter [email protected].

Assistance téléphonique: États-Unis | +1 (617) 500-0790 Europe | +36 70 574 8001 Le reste du monde | +1 (617) 500-0790

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Appareils, réactifs et fournitures

Recommandations en Équipement technique § Thermocycleur, format 96 puits § Fluoromètre de plaque (ou un autre instrument de détection par fluorescence de format 96 puits pour utiliser avec le Système Promega QuantiFluor dsDNA double brin) § Pippin Prep (cat#PIP001) ou Blue Pippin (cat #BLU0001) fabriqués par SAGE Science § Instrument de qPCR, de format de plaque 96 ou 384 puits § Illumina MiSeq (cat#SY-410-1003) § Ordinateur 64-bit 4 cœurs ou plus, et 16 Go de RAM § Stockage des données à long terme (approximativement 2 To par MiSeq par an)

Recommandations en matière de réactifs associés § Trousses PCR LongRange de Qiagen (Cat# 206401, 206402 ou 206403)

§

§ § §

§

§ § § § §

§ Chaque échantillon nécessite 4 μl d’enzyme Taq Polymerase § La trousse LongRange PCR Cat# 206401 (20) contient 8 μl d’enzyme Taq Polymerase § La trousse LongRange PCR Cat# 206402 (100) contient 40 μl d’enzyme Taq Polymerase § La trousse LongRange PCR Cat# 206403 (250) contient 100 μl d’enzyme Taq Polymerase ExoSAP-IT par Affymetrix (Cat# 78200, 78201, 78202, ou 78205) § Chaque échantillon nécessite 4 μl d’enzyme ExoSAP-IT § Cat# 78200 contenant 200 μl d’enzyme ExoSAP-IT § Cat# 78201 contenant 1 ml d’enzyme ExoSAP-IT § Cat# 78202 contenant 4 ml d’enzyme ExoSAP-IT § Cat# 78205 contenant 10 ml d’enzyme ExoSAP-IT Trousse de quantification de librairie – Illumina/Universal par KAPA Biosystems (Cat# KK4824) Système QuantiFluor dsDNA de Promega (Cat# E2670) Billes AMPure XP Agencourt AMPure XP par Beckman Coulter (Cat# A63880, A63881, ou A63882) § Chaque utilisation de Holotype HLA nécessite 900 μl de billes AMpure XP § Cat# A63880 contenant 5 ml de billes AMPure XP § Cat# A63881 contenant 60 ml de billes AMPure XP § Cat# A63882 contenant 450 ml de billes AMPure XP Cassette de Gel d’agarose 1,5%, sans colorant pour le Pippin Prep/Blue Pippin (cat #CDF1510 pour le Pippin Prep et BDF1510 pour le Blue Pippin) Éthanol pour biologie moléculaire (molecular grade) Eau stérile pour biologie moléculaire (sans DNase et RNase) Hydroxyde de sodium 1× TE buffer (pH 8.0) Trousse de réactifs MiSeq d’Illumina o Trousse de réactifs MiSeq v2 (500-cycle) Cat# MS-102-2003 o Trousse de réactifs MiSeq v2 (500-cycle) Cat# MS-103-1003 o Trousse de réactifs MiSeq v2 (300-cycle) Cat# MS-102-2002 o Trousse de réactifs MiSeq v2 (300-cycle) Cat# MS-103-1002 o Trousse de réactifs MiSeq v2 (300-cycle) Cat# MS-103-1001

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Capacité des trousses de Réactifs MiSeq Trousse réactifs Illumina MiSeq Std 500 Cycle (MS-102-2003) Std 300 Cycle (MS-102-2002) Micro 300 Cycle (MS-103-1002) Nano 500 Cycle (MS-103-2003) Nano 300 Cycle (MS-103-1001)

Temps Heure

Echantillons X2-96/7

~39

96

~24

80

~19

28

~28

12

~17

6



Fournitures recommandées

§ § §

§ § § § § § § § § § § § §

Tubes de micro centrifugation de 1,5 ml Tubes de micro centrifugation de 1,5 ml (type Low Bind) Tubes de micro centrifugation « Low Bind » de 2,0 ml (Eppendorf ADN LoBind (022431048) recommandé) Pipeteurs à volume réglable (capacité 1.0 - 1000 μl) Pipeteurs à volume réglable 8 canaux (capacité 2.0 - 500 μl) Plaques à 96 puits compatible avec le thermocycleur Plaques à 96 puits compatibles avec fluoromètre de plaque Plaques à 96 puits compatibles avec l’instrument de qPCR plaque Plaques à 96 puits profonds (capacité >1000 μl) Film adhésif pour plaques pour usage général Film adhésif pour plaques compatible avec le thermocycleur (testé en PCR Long Range) Film adhésif optique pour plaques compatible avec l’instrument de qPCR Support magnétique compatible avec des tubes micro centrifugation de 2 ml Portoirs PCR 96 puits pour refroidir (2 pièces) Tubes coniques de 50 ml Réservoirs de 50 ml

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Mention Légale Le Manuel de l’utilisateur Holotype HLA 96/7 et tout son contenu sont la propriété d’Omixon Biocomputing (« Omixon ») et ils sont exclusivement destinés à l’usage contractuel par le client par rapport au(x) produit(s) décrit(s) par le présent et à aucune autre fin. Ce document et son contenu ne devrait être utilisé ou distribué à aucune autre fin et/ou, par ailleurs, communiqué, divulgué ou reproduit sans le consentement écrit préalable d’Omixon. Omixon ne concède par ce document aucune licence avec ses droits de patente, de marque, d’auteur ou de droit commun ou autre droits similaires d’aucun tiers. Omixon Target HLA Twin (« Logiciel ») est concédé sous licence sous les termes et conditions du « Omixon Target HLA Twin EULA » (www.omixon.com/hla--twin--eula/). En cas de désaccord avec les termes et les conditions stipulés, Omixon ne cèdera pas de licence et n’autorisera pas l’utilisation ou à l’installation le logiciel. Les instructions de ce document doivent être strictement et explicitement suivies par un personnel qualifié et parfaitement formé afin de garantir une utilisation correcte et sûre du(es) produit(s) décrit(s) ici. Le contenu de ce document doit être intégralement lu et compris avant toute utilisation du (des) produit(s). TOUT MANQUEMENT À LA LECTURE COMPLÈTE OU AU SUIVI STRICTE DES INSTRUCTIONS CONTENUES DANS LE PRÉSENT DOCUMENT POURRAIT ENTRAINER LA DÉGRADATION DU (DES) PRODUIT(S) OU DES BLESSURES À DES PERSONNES Y COMPRIS LES UTILISATEURS OU D’AUTRES PERSONNES ET DES DÉGATS SUR D’AUTRES MATÉRIELS. OMIXON DÉCLINE TOUTE RESPONSABILITÉ LIÉE Á UN USAGE IMPROPRE DU (DES) PRODUIT(S) DÉCRIT(S) ICI (Y COMPRIS DES PARTIES DE CELUI-CI OU LE LOGICIEL) OU L’UTILISATION DU PRODUIT EN DEHORS DU CHAMP D’APPLICATION STRICTE DES LICENCES OU AUTORISATIONS DELIVRÉ PAR OMIXION DANS LE CADRE DE L’AQUISITION PAR LE CLIENT DU (DES) PRODUIT(S). USAGE LIMITÉ AU DOMAINE DE LA RECHERCHE © 2015 Omixon Ltd. Tous droits réservés.

Usage visé Holotype HLA 96/7 - configuration A & CE – nommé ci-après « Holotype HLA », est un produit, combinant des réactifs pour test de diagnostic in vitro, et un logiciel d’analyse de données (Omixon HLA Twin TM). Il vise à identifier et à définir les antigènes des leucocytes humains (Human Leukocyte Antigen - HLA) de classe I et II. Il est utilisé pour le typage HLA avec la plateforme NGS Illumina MiSeq. Holotype HLA fournit des informations sur l’histocompatibilité humaine pour les loci HLA Classe I (A, B et C) et classe II (DPB1, DQA1, DQB1 et DRB1) en utilisant de l’ADN génomique humain. Le logiciel Omixon HLA Twin TM inclus dans Holotype HLA, sert à trouver les concordances et à analyser données de séquence générées par le MiSeq du système Illumina®, aboutissant, à un typage HLA haute Omixon Holotype HLA 96/7 Configuration A & CE et Configuration B & CE Guide d’Utilisation V9. Copyright© 2016, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel & Propriété d’Omixon

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précision, de niveau allélique quatre digits avec un taux d’ambiguïté très bas. Holotype HLA est un produit destiné au diagnostic in vitro effectué par du personnel de santé professionnel, tel que des techniciens de laboratoire ou des médecins, formés au typage HLA dans des laboratoires de diagnostic accrédités EFI ou ASHI ou capable de travailler selon les spécifications EFI ou ASHI.

Note importante avant de commencer Recommandation en terme d’isolation d’ADN génomique L’ADN génomique Humain (ADNg) doit être préparé avec des kits de préparation d’ADN convenablement testés, disponibles sur le marché, et ceci, pour assurer la constance de la qualité de la préparation. Quelle que soit l’approche, une détermination précise de la concentration et de la pureté est requise pour une performance de test robuste. L’ADN doit être dépourvu de contaminants pouvant affecter l’amplification, la préparation de la librairie et les étapes de séquençage (par ex. alcool, sels, détergents, formaldéhyde et héparine). Le sang ne doit pas être collecté dans des tubes héparinés et les échantillons de sang des patients sous traitement à l’héparine doivent être écartés. De la même façon, les échantillons lipémiques ou hémolysés ne doivent pas être utilisés. L’ADN génomique peut être utilisé immédiatement s’il a été préparé dans de l’eau non contaminée en nucléase ou s’il a été stocké longtemps à une température égale ou inférieure à -20°C dans une solution de tampon TE. Les cycles répétés de congélation/décongélation doivent être évités afin de réduire sa dégradation. Une concentration de 20-30ng/µl d’ADN est hautement recommandée afin d’obtenir 100-150ng d’apport d’ADN génomique par amplification PCR. Un rapport d’absorbance 260 nm/280 nm et 260 nm/230 nm de valeur 1,7-2 sont fortement recommandés.

Le principe de la méthode Pendant longtemps, la communauté HLA s’est efforcée de mettre au point une méthode capable d’identifier avec précision, le considérable polymorphisme de l’antigène HLA et de leurs produits génétiques. La PCR, combinée à d’autres technologies (séquençage Sanger, SSOP, SSP, Luminex), a permis une amélioration notable de la description du polymorphisme HLA, mais néanmoins, plusieurs limites continuent à restreindre notre capacité à caractériser les gènes HLA de manière exhaustive. Ces dernières années, de nouvelles technologies collectivement nommées séquençage de nouvelle génération ou NGS (Next Generation Sequencing) ont apporté des possibilités inédites permettant une description complète des gènes HLA de façon haploïde. Le séquençage haut débit se caractérise par deux particularités : 1) le séquençage clonal de fragments d’ADN et 2) un débit extrêmement élevé. Le NGS permet de voir les polymorphismes, éliminant ainsi les ambiguïtés et permettant le typage HLA à trois ou quatre digits sans tests de contrôle, fournissant par conséquent, une solution potentiellement complète à la problématique du typage HLA. Le protocole décrit ci-dessous, combine une amplification PCR LongRange (longue portée), des gènes HLA avec le séquençage NGS sur une plateforme Illumina MiSeq. Plus spécifiquement, les loci HLA-A, B, C, DQA1 et DQB1 sont amplifiés sur la totalité de leur gène de codage, y compris des éléments des régions non traduits des extrémités 3’ et 5’, tandis que le locus DRB1 est partiellement amplifié de l’intron 1 à intron 4 et le DPB1 est amplifié de l’intron 1 à la Omixon Holotype HLA 96/7 Configuration A & CE et Configuration B & CE Guide d’Utilisation V9. Copyright© 2016, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel & Propriété d’Omixon

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région non traduite 3’. Les amplicons sont traités selon la procédure ci-dessous :

1.

Fragmentation enzymatique des amplicons, afin d’adapter leur taille au séquençage sur la plateforme Illumina.

2.

Traitement des extrémités des amplicons fragmentés.

3.

Ligation des séquences d’adaptateur qui sont utilisées tout au long du processus sur le MiSeq pour capturer, amplifier et séquencer l’ADN. Les adaptateurs contiennent également un indice qui est une courte séquence, unique à chaque adaptateur et qui identifie les origines de chaque librairie (échantillon/locus).

Après le pool (mise en commun) des Librairies (bibliothèques), la sélection des tailles et la quantification, les échantillons sont chargés sur le MiSeq pour le séquençage. Le processus, dans son intégralité, prend entre 3 à 5 jours selon la cellule choisie sur la plateforme Illumina. Ci-dessous le schéma résumant les étapes du protocole:

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Résumé des étapes techniques



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Glossaire/Définitions § Plaque de dilution d’amplicons – Plaque à 96 puits profonds, utilisée pour diluer les amplicons de la plaque d’amplicons prête à être quantifiée. Plaque d’amplicons – également appelé plaques d’amplification ; Dans le cas du DQB1 le contenu des deux plaques d’amplification (set 1 et set 2) sont combinés pour former la plaque d’amplicon. § Plaque de quantification d’amplicons : plaque 96 puits compatible le fluomomètre de plaque où sont quantifié les amplicons dilués. § Plaque d’amplification : plaque 96 puits servant à amplifier les loci HLA. § Librairie finale : librairie regroupant toutes les librairies d’échantillons prêtes à être séquencées dans un run unique de MiSeq. § Plaque de Réaction : Plaque sur laquelle les réactions séquentielles qui fragmentent, réparent des extrémités et ligaturent les adaptateurs indexés à amplicons sont exécutées. § Plaque de Réactif : Plaque servant à aliquoter les différents réactifs utilisés pour préparer les librairies § Librairie d’échantillon : librairie obtenue en combinant (poolant) tous les loci HLA d’un échantillon donné. § Plaque de librairie d’échantillon : plaque contenant une librairie d’échantillon (tous les loci combinés) par puit. § Plaque de Quantification des Standards – plaque à 96 puits compatible avec le fluoromètre de plaque où sont placés les standards d’ADN pour permettre la quantification d’amplicon. §

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Étape 1 – Amplification HLA et préparation du Master Mix Durée : ~2 heures 10 minutes Cette étape vise à préparer des Master mix spécifiques pour amplifier chaque locus HLA. Les loci amplifiés par ce protocole sont le HLA-A, le HLA-B, le HLA-C, HLA-DRB1, le HLA-DQB1, le HLA-DPB1 et le HLA-DQA1., Pour le HLA DQB1, deux sets de primer sont fournis : Le Set 1 amplifie les exons 1 à 4 et le Set 2 amplifie les exons 2 à 5, Chacun des sets est suffisant pour obtenir des résultats de génotypage précis, dans l'hypothèse d'une amplification réussie. Le taux d'échec d'amplification du set 1 est supérieur à celui recommandé pour un génotypage fiable. C'est pourquoi, Omixon préconise l'utilisation du Set 2 seul pour le génotypage à des fins cliniques. Le Set 1 est optionnel, il recommandé lorsque la couverture complète du gène DQB1 Exon 1 et intron 1 est souhaitée. Remarque : Tous les réactifs nécessaires pour l’amplification sont inclus dans les Master Mix de cette étape excepté le mélange enzymatique LongRange PCR.

Liste de réactifs

Objet Primer Mix HLA-A Primer Mix HLA-B Primer Mix HLA-C Primer Mix HLA-DQB1 (Set 1) optionnel Primer Mix HLA-DQB1 (Set 2) requis Primer Mix HLA-DRB1 Primer Mix HLA-DQA1 Primer Mix HLA-DPB1 Primer d’amplification DQB 1 Primer d’amplification DQB 2 Tampon (buffer) PCR LongRange (10×) 10 mM dNTPs H2O stérile à usage moléculaire

Conservation –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C

Source Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Qiagen Qiagen Qiagen



Protocole 1.1

- Sortir du kit tous les primer mix, le primer d’amplification DQB 1, le primer d’amplification DQB 2 et le tampon (buffer PCR LongRange) (10X) et les décongeler à température ambiante.

1.2

- Créer le primer d’amplification DQB combiné. Ajouter 132 μl du primer d’amplification DQB 2 directement dans le tube de le primer d’amplification DQB 1 et ré-étiquetez le tube en tant que primer d’amplification DQB combiné

1.3

- Créer un Master Mix pour chaque Primer Mix suivant les tableaux ci-dessous :

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Master Mix : HLA-A, B, C, DRB1, DPB1 et DQA1

Réactif Primer mix Tampon (buffer) PCR LongRange (10×) dNTP Mix (10 mM chacun) H2O stérile à us. moléculaire Volume total

Volume / éch. /locus 2 μl 2,5 μl 1,25 μl 13,85 μl 19,6 μl

Volume / 96 éch. / locus 204 μl 255 μl 127,5 μl 1412,7 μl 1999,2 μl



Master Mix: HLA-DQB1 Set 1 (optionnel) et DQB1 Set 2 (requis)

Réactif Primer mix Tampon PCR LongRange (10×) dNTP Mix (10 mM chacun) Primer d’amplification DQB combiné H 2O stérile à us. moléculaire Volume total

Volume / éch. /locus 2 μl 2,5 μl 1,25 μl 5,6 μl 7,85 μl 19,2 μl

Volume / 96 éch. / locus 204 μl 255 μl 127,5 μl 571,2 μl 800,7 μl 1958,4 μl



1.4 1.5

Vortexer chaque Master Mix et centrifuger pendant 1 seconde. Placer les Master Mix sur de la glace. Diluer tous les ADN génomiques de façon à obtenir une concentration entre 20 et 30 ng/μl (volume minimal 45µl).

Remarque : Le Holotype HLA contient suffisamment de réactifs pour 96 réactions et un peu de volume supplémentaire pour tenir compte des pertes dues au pipetage et aux amplifications échouées.

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Étape 2 – Amplification HLA Classe I et II Durée : ~8 heures 10 minutes L’étape 2 a pour objectif d’amplifier les loci HLA. Les conditions de l’amplification HLA Classe I et Classe II ont été optimisées sur deux programmes de PCR distincts. Une fois les réactions PCR terminées, l’amplification est vérifiée sur gel d’agarose.

Liste de réactifs

Objet Master Mix HLA-A Master Mix HLA-B Master Mix HLA-C Master Mix HLA-DPB1 Master Mix HLA-DQB1 (Set 1) Master Mix HLA-DQB1 (Set 2) Master Mix HLA-DRB1 Master Mix HLA-DQA1 Enzyme Mix Taq Polymerase ADN génomique H2O stérile à usage moléculaire

Conservation –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C –20 °C 4 °C 20 °C

Source Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Étape 1 Qiagen Utilisateur Utilisateur

Protocole 2.1

Sortir de l’emballage l’enzyme Mix Taq Polymerase, la centrifuger et l’ajouter à chaque Master Mix en vidant la pipette soigneusement à chaque fois. suivre le tableau ci-dessous :

Master Mix avec enzyme Taq Polymerase : HLA-A, B, C, DRB1, DQA1 et DPB1 Réactif Master Mix de l’étape 1 Enzyme Mix Taq Polymerase Total

Vol. / échantillon / locus 19,6 μl 0,4 μl 20 μl

Vol. / 96 échantillons / locus 1999,2 μl 40,8 μl 2040 μl



Master Mix avec enzyme Taq Polymerase : HLA-DQB1 Set 1 (optionnel) et HLA-DQB1 Set 2 (requis)

Réactif Master Mix de l’étape 1 Enzyme Mix Taq Polymerase Total

Vol. / échantillon / locus 19,2 μl 0,8 μl 20 μl

Vol. / 96 échantillons / locus 1958,4 μL 81,6 μl 2040μl



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2.2

Vortexer brièvement et centrifuger les Master Mix chargés en enzyme. Aliquoter 20µl de chaque Master Mix chargés en enzyme dans les puits séparés de plaques PCR 96 puits. Ajouter l’enzyme Taq Polymerase à chaque Master Mix.



Remarque : les amplifications de classe I et II ont été optimisées en utilisant deux programmes PCR distincts, de ce fait, chacune d’entre elles nécessite une Plaque de PCR à 96 puits séparée.

2.3

Ajouter 5 μl de chaque échantillon d’ADN génomique dilué dans les puits correspondants de chacune des plaques préparées dans l’étape précédente. Mixer par pipetage. Sceller et inspecter visuellement chaque puits. Centrifuger toutes les plaques d’amplification.

2.4

Placer les plaques d’amplification dans des thermocycleurs séparés et exécuter les programmes suivants pour l’amplification de classe I et II :

Amplification de classe I (HLA-A, B et C)

Nombre de cycles 1

35 1 1

Température 95 °C 95 °C 65 °C 68 °C 68 °C 4 °C

Durée 3 minutes 15 secondes 30 secondes 5 minutes 10 minutes ∞

Amplification de classe II (HLA-DRB1, DQB1 set 1, DQB1 set 2, DPB1, et DQA1)

Nombre de cycles 1

35 1 1

2.5

Température 95 °C 93 °C 60 °C 68 °C 68 °C 4 °C

Durée 3 minutes 15 secondes 30 secondes 9 minutes 10 minutes ∞

Vérifier le succès de la réaction d’amplification en employant 2 μl de chaque amplicon sur gel d’agarose 2 % standard, à 250 V pendant 30 minutes.

Tailles attendues des Amplicons Locus HLA HLA-A, B et C HLA-DRB1 HLA-DQB1 (Set 1) HLA-DQB1 (Set 2) HLA-DQA1 HLA-DPB1

Tailles attendues des Amplicons (kb) ~3 kb ~4,3 kb ~4,7 kb ~5,8 kb ~4,5 kb ~4,5 kb

Possibilité de pause sans risque d’altérer la manipulation : Les amplicons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’au lendemain ou pour les conserver plus longtemps, les stocker à -20 °C.

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Étapes 3 – Quantification et normalisation des Amplicons (avec fluoromètre de plaque) Durée : ~1 heure La quantification et la normalisation des Amplicons bien qu’optionnelle, sont fortement recommandées pour assurer un apport précis dans l’étape de préparation des librairies. La concentration des Amplicons est mesurée à l’aide du Quantifluor dsDNA System. Le QuantiFluor dsDNA System contient un marqueur fluorescent se fixant sur l’ADN et un standard ADN Lambda qui permet de réaliser une quantification précise de petites quantités d’ADN double brin. Se référer à l’annexe 3 en ce qui concerne les instructions d’utilisation de l’appareil à PCR pour effectuer la quantification des amplicons.

Liste des réactifs

Objet Plaque(s) d’Amplification Classe I Plaque(s) d’Amplification Classe II ADN Standard Lambda (100 ng/μL) Colorant ADN double brin QuantiFluor 200× Tampon (buffer) TE 20× (pH 7.5) H2O stérile à usage moléculaire ExoSAP-iT

Conservation 4 °C 4 °C 4 °C 4 °C 4 °C 20 °C à 25 °C -20°C

Source Étape 2 Étape 2 Promega Promega Promega Utilisateur Affymetrix

Protocole 3.1

– Préparer des standards d’ADN par dilution sérielle en utilisant de l’ADN standard QuantiFluor “Lambda” (100 ng/μL) suivant le tableau de dilution ci-dessous :

Étiquette sur le tube ADN utilisée Volume d’ADN Volume du TE 1x Conc. finale (ng/μl) (μl) (μl) Standard 1 ADN Lambda 7,5 μl 492,5 μl 1,5 ng/μl Standard 2 Standard 1 250 μl 250 μl 0,75 ng/μl Standard 3 Standard 2 250 μl 250 μl 0,38 ng/μl Standard 4 Standard 3 250 μl 250 μl 0,19 ng/μl Standard 5 Standard 4 250 μl 250 μl 0,09 ng/μl Standard 6 Standard 5 250 μl 250 μl 0,05 ng/μl Blanc Blanc 0 μl 250 μl 0 ng/μl

3.2

Préparer des Plaques de Dilution d’Amplicons pour chaque locus : Aliquoter 498 μl de tampon TE 1x dans des plaques à puits profonds à 96 puits à partir des plaques d’amplicons. Ajouter 2 μl d’ADN amplifié à partir des Plaques d’Amplicons vers les puits correspondants de la Plaque de Dilution d’Amplicons, bien vider la pipette par pipetage. Sceller la plaque et bien vortexer. Centrifuger la plaque.

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3.3

Préparer une solution 1x de Colorant QuantiFluor selon la formule suivante : 0,5 μl de Colorant QuantiFluor (200X) + 99,5 μl de tampon 1× TE. Préparer suffisamment de solution 1x de Colorant QuantiFluor pour que chaque échantillon (total des échantillons des Plaques d’Amplicons) et que chaque standard (14 au total) puissent avoir 100 μl d’aliquote.

3.4

Préparer une plaque de quantification des standards et des plaques de quantification d’Amplicons. Aliquoter 100 μl de solution 1x de colorant QuantiFluor à des puits dans les plaques optiques neuves à 96 puits en se référant au format de la plaque de quantification des standards et les plaques de quantification d’Amplicons (voir les figures en annexe).

3.5

Ajouter 100 μl de chaque standard préparé plus haut, en double, à des puits individuels dans la plaque de quantification des standards (14 puits au total). Mixer par pipetage.

3.6

Ajouter 100 μl d’amplicons dilués, prélevés dans les puits correspondants des plaques de dilution d’amplicons dans les puits individuels des plaques de quantification d’amplicons. Mixer par pipetage.

3.7

Effectuer un run de la plaque de quantification des standards dans le fluoromètre, puis faire de même avec la plaque de quantification d’amplicons.

3.8

Calculer la concentration d’ADN des plaques de quantification d’amplicons grâce aux données RFU générées par le fluoromètre.

3.9

Diluer l’ADN dans les Plaques d’Amplicons avec de l’H2O stérile pour que la concentration finale d’ADN soit de 67 ng/μl environ.

3.10

§

Si la concentration de l’ADN est ≥ 150 ng/μl : ajouter 25 μl de H2O

§

Si la concentration de l’ADN est 100–150 ng/μl : ajouter 10 μl de H2O

§

Si la concentration de l’ADN est ≤ 100 ng/μl : ne pas ajouter de H2O

Pour chaque échantillon, mélanger 15 μl du DQB1 (Set 1) et du DQB1 (Set 2) dans un puit inutilisé. Remarque : Le DQB1 Set 1 et Set 2 amplifient tous les deux les exons 2, 3 et 4. Si l’une des réactions DQB1 échoue ou est sensiblement plus faible que l’autre, elles ne doivent pas être combinées à une réaction réussie, pour ne pas diluer une bonne amplification.

3.11

Pour chaque échantillon, pooler tous les loci dans une seule plaque d’amplicons. Combiner 5 μl de chaque locus d’un échantillon dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits. Chaque échantillon doit occuper un seul puits d’un volume de 35 μl. Quand le locus final de chaque échantillon est ajouté, mixer bien à l’aide d’une pipette.

3.12

Aliquoter 4 μl d’ExoSAP-IT (Affymetrix) dans chaque amplicon dans la plaque d’amplicons et mixer par pipetage.

3.13

Sceller la plaque d’amplicons par un joint thermique et centrifuger.

3.14

Placer les Plaques d’Amplicons dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant :





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Purification des produits de PCR avec ExoSAP-IT

Nombre de cycles 1 1 1

Température 37 °C 80 °C 4 °C

Durée 45 minutes 15 minutes ∞

Possibilité de pause sans risque d’altérer la manipulation. Les amplicons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’au lendemain ou pour les conserver plus longtemps, les stocker à -20 °C.

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Étape 4 – Préparation de librairies Durée : ~3 heures et 15 minutes Au cours de cette étape, les librairies d’amplicons sont préparées pour le séquençage sur le MiSeq Illumina. La fragmentation des fragments d’ADN longs se fait par réaction enzymatique. Les extrémités sont ensuite réparées et adénylées, et les adaptateurs sont ligaturés aux extrémités. Les librairies indexées sont poolées et purifiées pour atteindre la concentration correspondante à l’étape des billes AMPure XP. Remarque : Omixon conseille d’utiliser des volumes plus importants que nécessaire pour 96 échantillons car certains des enzymes et des tampons sont visqueux ce qui peut provoquer une perte excessive lors du pipetage.

Liste de réactifs

Objet Plaque d’Amplicons Plaque d’adaptateurs (5 μL par puits) Enzyme de fragmentation (A) Tampon de fragmentation (B) Enzyme de réparation des extrémités (C) Tampon de réparation des extrémités (C) Enzyme de ligation (E) Tampon de ligation (F) Billes AMPure XP Éthanol à 80 % (fraichement préparé) H2O stérile à usage moléculaire

Conservation 4°C –20°C –20°C –20°C –20°C –20°C –20°C –20°C 4 °C 20°C à 25°C 20°C à 25°C

Source Étape 3 Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Omixon Beckman Coulter Utilisateur Utilisateur



Protocole 4.1

Mettre le thermocycleur en marche. Vérifier que le couvercle chauffant est en train de se chauffer. Remarque : Veiller à vortexer vigoureusement l’enzyme de fragmentation (A) avant utilisation.

4.2

Préparer le Master Mix de fragmentation en suivant le tableau ci-dessous :



Master Mix de fragmentation

Réactif Enzyme de fragmentation (A) Tampon de fragmentation (B) Volume total

Volume par Volumes recommandés par Code couleur librairie (μl) plaque complète (μl) 2 μl 220,8 μl Jaune 2 μl 220,8 μl Rouge 4 μl 441,6 μl

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4.3

Préparer une plaque de réactifs. Placer une nouvelle plaque PCR à 96 puits sur le portoir PCR à bloc froid et aliquoter une quantité égale de Master Mix de Fragmentation dans chaque puits d’une colonne. Remarque : La réaction de fragmentation a été conçue pour que l’ADN obtenu soit de la taille idéale pour réaliser un séquençage sur le MiSeq Illumina. Il est important de conserver les réactifs au frais jusqu’au démarrage de la réaction dans le thermocycleur pour empêcher une fragmentation excessive. Il est recommandé d’utiliser des pipettes multicanaux pour réduire la possibilité d’une fragmentation excessive.

4.4

Centrifuger la plaque d’amplicons pendant 10 secondes et la placer sur de la glace.

4.5

Préparer une plaque de réaction. Placer une nouvelle plaque PCR à 96 puits sur le portoir PCR à bloc froid pour les refroidir.

4.6

À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquoter 4 μl de Master Mix de fragmentation à partir de la plaque des réactifs vers les puits de la plaque de réaction en correspondance avec la plaque d’amplicons.

4.7

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 16 µl de chaque amplicon de la plaque d’amplicons vers les puits correspondants sur la plaque de réaction. Mixer par pipetage.

4.8

Couvrir la plaque de réaction par un joint thermique et centrifuger pendant 10 secondes.

4.9

Laisser incuber la plaque de réaction dans le thermocycleur selon le programme suivant :



Programme de fragmentation

Nombre de Cycles 1 1 1

Température 37 °C 70 °C 4 °C

durée 10 minutes 15 minutes ∞



Possibilité de pause sans risque d’altérer la manipulation : Les amplicons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’au lendemain ou, pour les conserver plus longtemps, les stocker à -20 °C. 4.10

Préparer le Master Mix de réparation des extrémités en suivant le tableau cidessous :

Master Mix de réparation des extrémités

Réactif H2O stérile à usage moléculaire Enzyme de Réparation des Extrémités (C) Tampon de Réparation des Extrémités (D) Volume total

Volume par librairie (μl) 1,25 μl 1,25 μl 2,5 μl 5 μl

Volumes recommandés Code pour 96 librairies (μl) couleur 139,2 μl 139,2 μl 278,4 μl 556,8 μl

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Vert Orange

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4.11

Aliquoter une quantité égale de Master Mix vers une nouvelle colonne de la plaque de réactifs.

4.12

Centrifuger la plaque de réactions (contenant les échantillons fragmentés) pendant 10 secondes. Aliquoter 5 μl de Master Mix de réparation des extrémités à partir de la plaque des réactifs à la Plaque de Réaction, Mixer bien par pipetage.

4.13

Couvrir la Plaque de Réaction par un joint thermique et centrifuger pendant 10 secondes.

4.14

Laisser incuber la Plaque de Réaction dans le thermocycleur selon le programme suivant :



Programme de réparation des extrémités

Nombre de cycles 1 1 1

Température 20 °C 65 °C 4 °C

Durée 30 minutes 30 minutes ∞



Possibilité de pause sans altérer la manipulation : Les amplicons peuvent être conservés à 4°C jusqu’au lendemain ou, si pour les conserver plus longtemps, on peut les stocker à -20°C. 4.15

Retirer la Plaque des Adaptateurs indexés du congélateur (-20°C) et laisser décongeler à température ambiante dès que le programme de réparation des extrémités a démarré dans le thermocycleur. Lorsque la plaque des adaptateurs est à température ambiante, la centrifuger 3 minutes à 3000 tr/min.

4.16

Retirer délicatement le film de la plaque des adaptateurs, ne pas trop secouer la plaque des adaptateurs afin d’éviter la contamination croisée.

4.17

Transférer le volume complet de chaque puits depuis la plaque de réaction (25 µl) vers les puits correspondant de la plaque des adaptateurs. Remarque : Si la totalité de la plaque des adaptateurs n’est pas utilisée, il est possible d’utiliser uniquement le nombre nécessaire d’adaptateurs. Couper le film de la plaque entre les puits à utiliser et les puits à garder. Retirer délicatement le film de la plaque des adaptateurs, laissant le film en place au-dessus des puits à garder.

4.18

a.

Transférer 25 µl de chaque échantillon de la plaque de réaction vers un puits non-utilisé dans la plaque des adaptateurs, bien mixer à l’aide d’une pipette.

b.

Transférer la totalité de chaque échantillon depuis de la plaque des adaptateurs vers le puit original de la plaque de réaction.

c.

Sceller de nouveau la plaque des adaptateurs et la remettre au congélateur (-20 °C). Utiliser la plaque de réaction au lieu de la plaque des adaptateurs pour les étapes restantes du manuel.

Préparer le Master Mix de ligation. Préparer suffisamment de Master Mix de ligation pour chaque échantillon dans la plaque de réaction.

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.

Master Mix de ligation

Réactif

Volume (μl)

Enzyme de Ligation (E) Tampon de Ligation (F) Volume total

2,5 μl 30 μl 32,5 μl

Volumes recommandés par plaque complète (μl) 252,5 μl 3030 μl 3282.5 μl

Code couleur Bleu Noir



4.19

Aliquoter le Master Mix de ligation dans une colonne neuve de la plaque des réactifs. L’utilisation d’une pipette multicanaux est recommandée.

4.20

Aliquoter 32,5 μl de Master Mix de ligation dans chaque puits de la plaque de réaction. L’utilisation d’une pipette multicanaux est recommandée. Mixer avec la pipette.

4.21

Couvrir la plaque des adaptateurs par un thermo-film et centrifuger pendant 10 secondes.

4.22

Laisser incuber la plaque des adaptateurs dans le thermocycleur selon le programme suivant :



Programme de ligation

Nombre de Cycles 1 1 1

Température 25 °C 65 °C 4 °C

durée 10 minutes 20 minutes ∞

Possibilité de pause sans altérer la manipulation : Les amplicons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’au lendemain ou, si pour les conserver longtemps, ils peuvent être stockés à -20 °C.

4.23

Mettre les billes AMPure XP à température ambiante, s’assurer l’ensemble est homogène (pas d’amas ou de grappes). Préparer 5 ml d’éthanol à 80% (4 ml d’EtOH + 1 ml de H2O).

4.24

Préparer la librairie en ajoutant tous les pools d’amplicons (librairie spécifique par échantillon) dans un aliquote versé dans un seul tube de micro centrifugation « Low Bind » (2,0 ml). I. Pour 16 échantillons et plus : Calculer la quantité de chaque librairie d’échantillon afin pooler en une seule librairie un volume total de 900 µl. Diviser 900 μl par le nombre des librairies d’amplicons. Cela donnera le volume d’aliquote à prendre de chaque amplicon et a pipeter dans la librairie. II. Pour moins de 16 échantillons : Transférer 60 μl de chaque librairie d’échantillons vers une librairie.

4.25

Ajouter 900 µl de billes AMPure XP au tube du pool final. Bien mixer sur un vortex et centrifuger brièvement. Veiller à ce que les billes ne se séparent pas. Laisser incuber la librairie pendant 10 minutes à température ambiante. Remarque : Si le volume du pool final est inférieur à 900 μl de librairie, ajouter un volume équivalent de billes AMPure XP. Le ratio librairie/ billes doit être 1:1.

4.26

Placer le tube du pool final sur le support magnétique pendant 10 minutes.

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4.27

Retirer avec précaution et jeter le surnageant du tube de librairie, en laissant le tube sur le support magnétique. Veiller à ne pas toucher les billes.

4.28

Ajouter au tube de librairie, toujours placé sur le support magnétique, 1,5 à 2 ml d’éthanol à 80% fraichement préparé, S’assurer que le volume d’éthanol soit suffisant pour recouvrir les billes. Remarque : Appliquer l’éthanol sur le côté du tube, où il n’y a pas de billes.

4.29

Laisser incuber la librairie à température ambiante pendant 30 secondes, puis, retirer soigneusement le surnageant et le jeter.

4.30

Répéter les étapes 4.28 et 4.29.

4.31

Centrifuger le tube de librairie pendant 5 secondes, remettre immédiatement le tube sur le support magnétique en le laissant ouvert, retirer l’éthanol résiduel à l’aide d’une pipette sans toucher les billes. Remarque : Veiller à ce que le culot de billes ne contienne pas d’éthanol résiduel. Cela peut nécessiter de bouger le tube sur le support magnétique afin d’enlever l’éthanol sans bouleverser le culot de billes.

4.32

laisser sécher les billes à l’air libre pendant 5-8 minutes sur le support magnétique, jusqu’à ce que le culot de billes soit sec.

4.33

Retirer le tube de librairie du support magnétique et éluer la librairie en versant 31 µl d’eau stérile à usage moléculaire sur les billes dans le tube. La pointe de la pipette ne doit pas toucher les billes car elles risqueraient d’y adhérer.

4.34

Vortexer le tube pour remettre en suspension les billes et centrifuger brièvement. Veiller à ce que les billes ne se séparent pas.

4.35

Laisser incuber la librairie à température ambiante pendant 2 minutes.

4.36

Placer le tube de librairie sur le support magnétique pendant 2 minutes.

4.37

Collecter la librairie : Tout en gardant la librairie finale sur le support magnétique, transférer 31 µl du surnageant vers un nouveau tube de micro centrifugation (type « Low Bind ») de 1,5 ml. Possibilité de pause sans altérer la manipulation : Les amplicons peuvent être conservés à 4 °C jusqu’au lendemain ou, pour les conserver longtemps, ils peuvent être stockés à -20 °C.

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Étape 5 – Sélection de la taille de librairie Durée : ~1 heure L’étape 5 consiste à utiliser la librairie de l’étape 4 pour effectuer une sélection de taille de fragment à l’aide d’un Pippin Prep. Le Pippin Prep sélectionne automatiquement une fourchette de tailles de fragments ADN et les élue dans une chambre de collection. Remarque : Un Blue Pippin peut être utilisé à la place d’un Pippin Prep. Voir en annexe 1 les instructions d’utilisation du Pippin Prep.

Liste de réactifs

Objet Cassette de gel d’agarose 1,5%, sans colorant Marker Mix / colorant de charge Pippin (étiqueté « K »)* Librairie poolée

Conservation 20°C à 25°C 4°C

Source Sage Science Sage Science





4°C

Étape 4



*Remarque : Le Marker K est utilisé avec le Pippin Prep. Le Blue Pippin utilise le Marker R2.

Protocole 5.1

Mettre le colorant de charge « marker K » à température ambiante.

5.2

Ajouter 31 µl du pool final nettoyé à 10 µl de solution de charge « Marker K ».

5.3

Mixer à l’aide d’un vortex et centrifuger.

5.4

Configurer le Pippin Prep pour recueillir les fragments d’ADN compris entre 650 et 1300 bases. Ajouter le 40 μl d’échantillons dans le puit de chargement et exécuter. La durée d’exécution est entre 45 à 50 minutes.

5.5

Recueillir tout le contenu (approximativement 40 µl) dans la chambre de collection de la cassette du Pippin Prep et le transférer dans un nouveau tube de micro centrifugation « Low Bind » de 1,5 ml. Ceci est la librairie sélectionnée par taille.

Possibilité de pause sans altérer la manipulation : Les librairies peuvent être conservées à 20°Cpour une période prolongée.

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Étape 6 – Quantification de la Librairie Durée : ~1 heure Il est nécessaire de quantifier la librairie sélectionnée par taille afin d’obtenir un résultat optimal sur le séquenceur MiSeq Illumina. La qPCR permet d’en mesurer avec précision la concentration.

Liste de réactifs

Objet Primer Premix Illumina 10× Master Mix KAPA SYBR FAST qPCR 2× Std 1 (20,0 pM) Std 2 (02,0 pM) Std 3 (0,20 pM) Std 4 (0,02 pM) Standards d’ADN Illumina H2O stérile à usage moléculaire Tampon TE 1 × (pH 8.0) Librairie sélectionnée par taille

Conservation -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C -20°C

Source KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems KAPA Biosystems Utilisateur Utilisateur Étape 5



4°C



Protocole 6.1

Préparer un Primer Mix qPCR à l’usage d’un Primer Premix Illumina 10× et d’un Master Mix KAPA SYBR FAST qPCR 2× : Remarque : La trousse qPCR KAPA SYBR FAST (qPCR Master Mix, Primer Premix et ROX) contient des réactifs qui sont combinés au cours de la première utilisation de la trousse. Les réactifs du kit KAPA SYBR FAST qPCR et le Primer Mix sont stables jusqu’à 30 cycles de congélation/décongélation au minimum.



Mix de primer pour la qPCR

Réactifs Primer Premix Illumina 10× Master Mix KAPA SYBR FAST qPCR 2× Volume total

Volume (ml) 1 ml 5 ml 6 ml



6.2

Préparer un Master Mix qPCR.

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Master Mix pour la qPCR

Réactif Primer Mix qPCR H2O stérile à usage moléculaire Volume total

Volume (μl) 228 μl 76 μl 304 μl





6.3

Préparer une série de dilutions de la librairie sélectionnée par taille.

a. b.

Préparer une dilution à 1:1000 en ajoutant 1 µl d’ADN de la librairie sélectionnée par taille à 999 µl de tampon TE 1x (pH 8.0), en veillant à soigneusement vider la pipette. Vortexer et centrifuger.. Préparer une dilution à 1:2000 en ajoutant 100 µl de la dilution à 1:1000 à 100 µl de tampon TE 1x (pH 8.0). Vortexer et centrifuger pendant 5 secondes.

6.4

Préparer une plaque de quantification qPCR dans une plaque PCR à 96 puits compatible à votre système qPCR.

6.5

Aliquoter 16 μl de Master Mix qPCR en triple pour les standards 1 à 4, une dilution à 1:1000 et une dilution à 1:2000 (voir les figures en annexe).

6.6

Aliquoter 4 μl des standards 1 à 4, la dilution 1:1000 et la dilution 1:2000 dans les puits correspondants.

6.7

Sceller la plaque de quantification qPCR et centrifuger pendant 10 secondes. Remarque : Veiller à réduire au maximum la production des bulles d’air dans les puits de la plaque de quantification qPCR.

6.8

Déterminer la concentration de l’ADN de la librairie sélectionnée par taille en utilisant la machine qPCR.

6.9

En utilisant les résultats de la plaque de quantification qPCR, diluer 10 μl de la librairie sélectionnée par taille afin de la porter à une concentration de 2 nM en ajoutant de la H2O stérile dans un nouveau tube de micro centrifugation « Low Bind » de 1,5 ml. Conserver la librairie sélectionnée par la taille restante à –20 °C.

Possibilité de pause sans altérer la manipulation : Les librairies peuvent être conservés à -20°C pendant une longue période, une re-quantification de la librairie est fortement recommandée avant d’exécuter le run sur le MiSeq.

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Étape 7 – Séquençage sur plateforme Illumina MiSeq Durée : ~ 40 heures 45 minutes La plateforme Illumina MiSeq est un instrument automatisé de NGS qui peut séquencer la librairie sélectionnée par taille, préparée dans les étapes précédentes. Tous les échantillons indexés sont démultiplexés automatiquement pendant le déroulement du séquençage. Petite astuce – vous pouvez utiliser un PhiX spike-in à 1% comme contrôle additionnel pour suivre la réaction de séquençage. Référez-vous à la documentation Illumina sur le contrôle PhiX pour de plus amples informations.

Liste de réactifs

Objet

Conservation

Source

Cartouche de réactifs HT1 PR2 MiSeq Flow Cell Librairie à 2 nM NaOH, 0,2 N H2O stérile

-20°C -20°C 4 °C 4 °C 4 °C 20 °C à 25 °C 20 °C à 25 °C

Illumina Illumina Illumina Illumina Étape 6 Utilisateur Utilisateur

Capacité des kits de réactifs MiSeq Kit de réactifs Illumina MiSeq Std 500 cycles (MS-102-2003) Std 300 cycles (MS-102-2002) Micro 300 cycles (MS-103-1002) Nano 500 cycles (MS-103-1003) Nano 300 cycles (MS-103-1001)

Durée en heures

X2-96/7 Échantillons

~39

96

~24

80

~19

28

~28

12

~17

6

Protocole 7.1

Préparer la plateforme MiSeq selon les protocoles standards d’Illumina.

7.2

Préparer une librairie dénaturée à 1 nM : Dans un nouveau tube de micro centrifugation (type « Low Bind ») de 1,5 ml, Combiner 10 μl de 0,2 N NaOH fraichement préparé et 10 μl de la librairie sélectionnée par taille diluée à 2 nM. Vortexer et centrifuger. Laisser incuber cette librairie Dénaturée à 1 nM à température ambiante pendant 5 minutes.

7.3

Préparer une librairie dénaturée à 20 pM : Ajouter 980 µl de HT1 refroidi et 20 µl de la solution de librairie dénaturée à 1 nM. Vortexer et centrifuger.

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7.4

Préparer une librairie dénaturée à 9 pM : Ajouter 550 µl de HT1 refroidi et 450 µl de la solution de librairie dénaturée à 20 pM dans un nouveau tube de micro centrifugation de 1,5 ml (type « Low Bind »). Vortexer et centrifuger pendant.

7.5

Aliquoter 600 μl de la librairie dénaturée à 9 pM dans le réservoir d’échantillons de charge de la cartouche de réactifs MiSeq. Petite astuce – Il est conseillé d’utiliser le workbook fournit pour créer la feuille d’échantillon requise pour le MiSeq.

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Étape 8 – Analyse des données du séquençage HLA Le MiSeq Illumina va traiter la Librairie poolée à 9 pM et générer des données de séquençage dans un fichier fastQ. Se référer au Manuel HLA Twin pour l’installation correcte de HLA Twin et pour les détails de l’interprétation de l’analyse de génotypage des données de séquençage. Pour en savoir plus sur la mise en œuvre du protocole automatisé et pour les questions liées à l’installation ou à l’analyse des données, merci de contacter [email protected].

Protocole pour le lancement automatisé des analyses Configuration et paramétrage informatique 1.

Installer le « Serveur HLA Twin » sur le poste « Serveur ».

2.

Installer HLA Twin Client sur le poste « client » – des clients HLA Twin multiples peuvent se connecter au serveur.

3.

Pour avoir des instructions personnalisées concernant l’automatisation, contacter les Services support Omixon ([email protected]).

Protocole pour exécuter l’analyse 1.

Démarrer le Client HLA Twin et identifiez-vous.

2.

Les données ont déjà été traitées ou elles sont en cours de traitement. Revoir les résultats en utilisant le Système de code couleur dans HLA Twin.

3.

Exporter les résultats et/ou les séquences consensus de génotypage à votre convenance.



Protocole pour le lancement manuel des analyses avec poste « server » Configuration et paramétrage informatique 1.

Installer HLA Twin Server sur le poste « server ».

2.

Installer HLA Twin Client sur le (s) poste (s) « client ».

Protocole pour exécuter l’analyse 1.

Démarrer Client HLA Twin et connecter-vous.

2.

Sélectionner les données MiSeq au format fastQ et démarrer l’exécution du typage HLA Holotype.

3.

Une fois le typage HLA Holotype terminé, revoir les résultats en utilisant le Système de code couleur dans HLA Twin.

4.

Exporter les résultats et/ou les séquences consensus de génotypage à votre convenance.

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Protocole pour le lancement manuel avec poste « Desktop » (bureau) Configuration et paramétrage informatique 1.

Installer « HLA Twin Desktop ».

Protocole pour exécuter l’analyse



1.

Démarrer HLA Twin et identifiez-vous.

2.

Sélectionner les données MiSeq au format fastQ et démarrer l’exécution du typage HLA Holotype.

3.

Une fois le typage HLA Holotype est terminé, revoir les résultats en utilisant le Système de code couleur dans HLA Twin.

4.

Exporter les résultats et/ou les séquences consensus de génotypage à votre convenance

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Figures supplémentaires Exemple de plaque pour plaque d’amplicon, plaque d’amplification, plaque de dilution, plaque de quantification d’amplicon (pour locus individuel) et plaque de réactions.



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Exemple de plaque de quantification Plaque de quantification des standards





Exemple de plaque qPCR



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Annexe 1 : Pippin Prep Programmer le Pippin Prep 1. 2.

Cliquer sur l’onglet d’éditeur de protocole et cliquer sur le bouton « New » (Nouveau). Cliquer sur l’icône de dossier à côté du champ Cassette et sélectionner « 1.5%DF Marker K » (« Marker K 1,5 % DF ») pour le Pippin Prep ou « 1.5%DF Marker R2 » (« Marker R2 1,5 % DF ») pour le Blue Pippin.

3.

Dans la piste en cours de programmation :

a. Mettre en lumière le champ « Range » (« Fourchette »). b. Paramétrer la valeur du champ « Ref Lane » (« Voie de Réf ») à correspondre au numéro de la piste dans laquelle vous travaillez.

c. Paramétrer la valeur du champ « Start* » (« Démarrer* ») à 650. d. Paramétrer la valeur du champ « End* » (« Arrêter* ») à 1300. 4. 5.

Dans le champ de la piste de référence, sélectionner la piste dans laquelle vous travaillez. Cliquer sur le bouton « Save As » (« Enregistrer sous ») et donner un nom à votre programme

Exécuter le Pippin Prep 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

8.

Démarrer le Pippin Prep en appuyant sur le bouton d’alimentation au dos de l’appareil. Examiner visuellement le Pippin Prep. Veiller à ce que les 5 LEDs soient allumés et que l’intérieur de l’appareil soit propre et sec. Cliquer sur le logo Sage Science en bas à droite de l’écran. Cela vous permettra de saisir votre mot de passe. Le mot de passe paramétré par défaut du fabricant est « pips ». Cliquer sur l’onglet « Factory Setup » (« Paramétrage d’usine ») et veiller à ce que la valeur « Base-to-Threshold » (« Base-à-Seuil ») soit paramétré à 0,02. Placer le dispositif d’étalonnage à l’intérieur du Pippin Prep, en veillant à ce que la bande foncée soit orientée vers le bas et passe au-dessus des lumières LED. Dans l’onglet « Main » (« Principal »), cliquer sur le bouton « Calibration » (« Étalonnage »). Dans la fenêtre de l’étalonnage, veiller à ce que le champ « Target I pH mA » (« mA pH I cible ») soit paramétré à 0,80 (0,60 pour le Blue Pippin) et ensuite cliquer sur le bouton « Calibrate » (« Étalonner »). Ouvrir l’onglet « Protocols » (« Protocoles »). Cliquer sur le bouton « Load » (« Charger ») et sélectionner le programme pour HLA Holotype et la piste spécifique que vous allez utiliser. Veiller à ce que :

a. b. c.

9.

La piste appropriée soit activée. L’indicateur de la sélection de large spectre soit allumé.

La piste de référence soit la même que celle qui sera exécutée. Ouvrir l’onglet « Main » (« Principal »). Veiller à ce que :

a. b.

10.

Le programme que vous avez chargé soit le même que celui qui est sélectionné. La piste de référence appropriée soit sélectionnée et qu’elle soit la même que celle de l’échantillon qui sera exécuté. Inspecter la cassette. Avant d’enlever le film scellant les puits, vérifier s’il y a des bulles d’air derrière l’accès à la chambre d’élution. Si des bulles d’air sont présentes derrière cet accès, taper délicatement la cassette dans votre main pour expulser les bulles d’air.

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11. 12.

13. 14. 15.

16. 17. 18.

19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

29. 30. 31. 32. 33. 34. 35.

Placer la cassette à l’intérieur du Pippin Prep avec le film toujours couvrant les puits. Retirer soigneusement le film, en veillant à enlever le film à partir du côté propre de la cassette (piste 5) vers le côté utilisé de la cassette (piste 1). S’assurer qu’aucun liquide n’est déversé au cours du retrait du film afin d’éviter tout risque de contamination. Enlever la totalité du tampon à partir de chaque puit d’accès à la chambre d’élution et y déposer 40 μl de nouveau tampon d’électrophorèse. Ajouter une fine bande de film au-dessus des puit d’accès à la chambre d’élution. Les réservoirs dont le niveau est inférieur au ¾ du volume total, doivent être complétés avec du tampon d’électrophorèse. Ne pas trop remplir les puits ! Le tampon doit tout juste atteindre le plastique du puits pour ne pas qu’il déborde lorsque le couvercle glisse. Appliquer le tampon en commençant par les puits propres (piste 5) et en continuant vers les puits utilisés (piste 1). S’assurer que chaque chambre de charge (puits avec agarose) est remplie de tampon d’électrophorèse. Le tampon doit juste recouvrir l’agarose, et avoir une apparence plate. Fermer lentement le Pippin Prep, en veillant à ce qu’à aucun endroit, le couvercle ne touche pas le tampon lorsque l’appareil se ferme. Réaliser le contrôle de continuité. Il arrive parfois, lorsque les capteurs sèchent un peu, que le contrôle échoue au premier essai. Si cela arrive, refaire le test, une fois qu’il a réussi ouvrir doucement le Pippin Prep. Vérifier que le couvercle ne fasse pas déborder de fluide sur la cassette. Vortexer brièvement votre Marker K et centrifuger. Ajouter 10 μl de Marker K à votre librairie de ~30 μl. Vortexer brièvement votre librairie et centrifuger. Enlever 40 μl de tampon du puits d’échantillon que vous allez utiliser. Ajouter env. 40 μl de tampon à partir de la librairie chargée de Marker K vers le puits d’échantillon que vous allez utiliser. Marquer la piste que vous utilisez en y inscrivant les initiales du technicien et la date. Fermer le Pippin Prep et cliquer sur le bouton « Start » (« Démarrer »). S’assurer que la piste appropriée ait été activée. L’exécution de l’échantillon doit durer 45 minutes environ. Une fois le run est terminé, ouvrir le Pippin Prep avec précaution. Vérifier que le couvercle ne fasse pas déborder de fluide sur la cassette. Enlever le film couvrant les puit d’accès à la chambre d’élution, ne pas toucher le liquide. Prélever la totalité de l’échantillon à partir du puit d’accès à la chambre d’élution et le transférer dans un tube Low Bind de 1,5ml propre. Couvrir tous les puits ouverts de deux pièces de film à sceller des plaques. Ne pas oublier de laisser une languette du côté propre. Cela facilitera l'enlèvement du film à partir du côté propre vers le côté utilisé. Placer la cassette scellée dans son emballage et la mettre de côté. Prendre la cassette de lavage et la remplir d’eau MiliQ. Fermer le couvercle du Pippin Prep avec précaution. Vérifier que le couvercle ne fasse pas déborder de fluide sur la cassette. Laisser le Pippin Prep fermé pendant quelques secondes. Ouvrir le Pippin Prep, Vérifier que le couvercle ne fasse pas déborder de fluide sur la cassette. Enlever la cassette de lavage en vidant l’eau de la cassette et la laisser sécher. Nettoyer toute eau versée sur le Pippin Prep et le fermer avec précaution.

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36.

Sélectionner le bouton « Shut Down » (« Éteindre ») dans le menu Pippin Prep

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Annexe 2 : Sample Sheet (Feuille de route) [Header],,,,,,, IEMFileVersion,4,,,,,, Investigator Name,RHP,,,,,, Experiment Name,030315S_RHP,,,,,, Date,3/3/15,,,,,, Workflow,GenerateFASTQ,,,,,, Application,FASTQ Only,,,,,, Assay,CHOP PCR Free,,,,,, Description,030315L_RHP,,,,,, Chemistry,Default,,,,,, ,,,,,,, [Reads],,,,,,, 251,,,,,,, 251,,,,,,, ,,,,,,, [Settings],,,,,,, Adapter,AGATCGGAAGAGCACACGTC,,,,,, AdapterRead2,AGATCGGAAGAGCGTCGTGT,,,,,, ,,,,,,, [Data],,,,,,, Sample_ID,Sample_Name,Sample_Plate,Sample_Well,I7_Index_ID,index,Sample_Project,Description 001__030315S_RHP_1,001__030315S_RHP_1,030315P_RHP,A1,1,TAAGTGATC,030315S_RHP, 002__030315S_RHP_2,002__030315S_RHP_2,030315P_RHP,B1,2,GTGGTATTC,030315S_RHP, 003__030315S_RHP_3,003__030315S_RHP_3,030315P_RHP,C1,3,ATAAGTACT,030315S_RHP, 004__030315S_RHP_4,004__030315S_RHP_4,030315P_RHP,D1,4,TAGGATTCA,030315S_RHP, 005__030315S_RHP_5,005__030315S_RHP_5,030315P_RHP,E1,5,AAGTGCATA,030315S_RHP, 006__030315S_RHP_6,006__030315S_RHP_6,030315P_RHP,F1,6,TACACACAA,030315S_RHP, 007__030315S_RHP_7,007__030315S_RHP_7,030315P_RHP,G1,7,TCTCCGAGC,030315S_RHP, 008__030315S_RHP_8,008__030315S_RHP_8,030315P_RHP,H1,8,AGTAACCGC,030315S_RHP, 009__030315S_RHP_9,009__030315S_RHP_9,030315P_RHP,A2,9,AGGCAAGTT,030315S_RHP, 010__030315S_RHP_10,010__030315S_RHP_10,030315P_RHP,B2,10,CCGTACTAT,030315S_RHP, 011__030315S_RHP_11,011__030315S_RHP_11,030315P_RHP,C2,11,GCCAGGTGC,030315S_RHP, 012__030315S_RHP_12,012__030315S_RHP_12,030315P_RHP,D2,12,CAACATCAC,030315S_RHP, 013__030315S_RHP_13,013__030315S_RHP_13,030315P_RHP,E2,13,GTCAGCACC,030315S_RHP, 014__030315S_RHP_14,014__030315S_RHP_14,030315P_RHP,F2,14,CTTGGCTGT,030315S_RHP, 015__030315S_RHP_15,015__030315S_RHP_15,030315P_RHP,G2,15,GTAGTACTA,030315S_RHP, 016__030315S_RHP_16,016__030315S_RHP_16,030315P_RHP,H2,16,GCAAGTCAA,030315S_RHP, 017__030315S_RHP_17,017__030315S_RHP_17,030315P_RHP,A3,17,ATTACTACC,030315S_RHP, 018__030315S_RHP_18,018__030315S_RHP_18,030315P_RHP,B3,18,CGCTCTAAT,030315S_RHP, 019__030315S_RHP_19,019__030315S_RHP_19,030315P_RHP,C3,19,ACTTCGGTC,030315S_RHP, 020__030315S_RHP_20,020__030315S_RHP_20,030315P_RHP,D3,20,TGGTACGAC,030315S_RHP, 021__030315S_RHP_21,021__030315S_RHP_21,030315P_RHP,E3,21,TGCATAATG,030315S_RHP, 022__030315S_RHP_22,022__030315S_RHP_22,030315P_RHP,F3,22,CTGGTTGGC,030315S_RHP, 023__030315S_RHP_23,023__030315S_RHP_23,030315P_RHP,G3,23,CTCTTATTC,030315S_RHP, 024__030315S_RHP_24,024__030315S_RHP_24,030315P_RHP,H3,24,AGGACTCTC,030315S_RHP, Omixon Holotype HLA 96/7 Configuration A & CE et Configuration B & CE Guide d’Utilisation V9. Copyright© 2016, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel & Propriété d’Omixon

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025__030315S_RHP_25,025__030315S_RHP_25,030315P_RHP,A4,25,GCATTCCAA,030315S_RHP, 026__030315S_RHP_26,026__030315S_RHP_26,030315P_RHP,B4,26,TCAAGGTCA,030315S_RHP, 027__030315S_RHP_27,027__030315S_RHP_27,030315P_RHP,C4,27,CACTCCGTT,030315S_RHP, 028__030315S_RHP_28,028__030315S_RHP_28,030315P_RHP,D4,28,CAGCCAGTT,030315S_RHP, 029__030315S_RHP_29,029__030315S_RHP_29,030315P_RHP,E4,29,AGCAGCACA,030315S_RHP, 030__030315S_RHP_30,030__030315S_RHP_30,030315P_RHP,F4,30,TTCCGTAAG,030315S_RHP, 031__030315S_RHP_31,031__030315S_RHP_31,030315P_RHP,G4,31,TCCTGTGGA,030315S_RHP, 032__030315S_RHP_32,032__030315S_RHP_32,030315P_RHP,H4,32,GTGATAGCC,030315S_RHP, 033__030315S_RHP_33,033__030315S_RHP_33,030315P_RHP,A5,33,TAGCTCTGA,030315S_RHP, 034__030315S_RHP_34,034__030315S_RHP_34,030315P_RHP,B5,34,GCGAGTTGA,030315S_RHP, 035__030315S_RHP_35,035__030315S_RHP_35,030315P_RHP,C5,35,TAGGTAATG,030315S_RHP, 036__030315S_RHP_36,036__030315S_RHP_36,030315P_RHP,D5,36,GTAACTATA,030315S_RHP, 037__030315S_RHP_37,037__030315S_RHP_37,030315P_RHP,E5,37,CTCCAGCCG,030315S_RHP, 038__030315S_RHP_38,038__030315S_RHP_38,030315P_RHP,F5,38,AATATACCG,030315S_RHP, 039__030315S_RHP_39,039__030315S_RHP_39,030315P_RHP,G5,39,GCGAGACGT,030315S_RHP, 040__030315S_RHP_40,040__030315S_RHP_40,030315P_RHP,H5,40,CCACCGGAT,030315S_RHP, 041__030315S_RHP_41,041__030315S_RHP_41,030315P_RHP,A6,41,CGACGAGGT,030315S_RHP, 042__030315S_RHP_42,042__030315S_RHP_42,030315P_RHP,B6,42,GCGCTGGCA,030315S_RHP, 043__030315S_RHP_43,043__030315S_RHP_43,030315P_RHP,C6,43,GGCACTAGG,030315S_RHP, 044__030315S_RHP_44,044__030315S_RHP_44,030315P_RHP,D6,44,CTGGAATCG,030315S_RHP, 045__030315S_RHP_45,045__030315S_RHP_45,030315P_RHP,E6,45,CTTGTTATC,030315S_RHP, 046__030315S_RHP_46,046__030315S_RHP_46,030315P_RHP,F6,46,AACCACTTA,030315S_RHP, 047__030315S_RHP_47,047__030315S_RHP_47,030315P_RHP,G6,47,GGCGCTTCT,030315S_RHP, 048__030315S_RHP_48,048__030315S_RHP_48,030315P_RHP,H6,48,CCGAGGCTT,030315S_RHP, 049__030315S_RHP_49,049__030315S_RHP_49,030315P_RHP,A7,49,TCGATCGTT,030315S_RHP, 050__030315S_RHP_50,050__030315S_RHP_50,030315P_RHP,B7,50,TTGGCTACG,030315S_RHP, 051__030315S_RHP_51,051__030315S_RHP_51,030315P_RHP,C7,51,TATTGCGTC,030315S_RHP, 052__030315S_RHP_52,052__030315S_RHP_52,030315P_RHP,D7,52,GATTCTAGG,030315S_RHP, 053__030315S_RHP_53,053__030315S_RHP_53,030315P_RHP,E7,53,TCCAACACT,030315S_RHP, 054__030315S_RHP_54,054__030315S_RHP_54,030315P_RHP,F7,54,TACCGAGGT,030315S_RHP, 055__030315S_RHP_55,055__030315S_RHP_55,030315P_RHP,G7,55,TTGTACCGA,030315S_RHP, 056__030315S_RHP_56,056__030315S_RHP_56,030315P_RHP,H7,56,TAGTGGAGG,030315S_RHP, 057__030315S_RHP_57,057__030315S_RHP_57,030315P_RHP,A8,57,GACCTGTTA,030315S_RHP, 058__030315S_RHP_58,058__030315S_RHP_58,030315P_RHP,B8,58,TTCTTCCTA,030315S_RHP, 059__030315S_RHP_59,059__030315S_RHP_59,030315P_RHP,C8,59,ATTCCGGTT,030315S_RHP, 060__030315S_RHP_60,060__030315S_RHP_60,030315P_RHP,D8,60,GTTAGGCTC,030315S_RHP, 061__030315S_RHP_61,061__030315S_RHP_61,030315P_RHP,E8,61,AGTCTGACT,030315S_RHP, 062__030315S_RHP_62,062__030315S_RHP_62,030315P_RHP,F8,62,ATACATAAC,030315S_RHP, 063__030315S_RHP_63,063__030315S_RHP_63,030315P_RHP,G8,63,CGTTACGGC,030315S_RHP, 064__030315S_RHP_64,064__030315S_RHP_64,030315P_RHP,H8,64,CCGCACTGG,030315S_RHP, 065__030315S_RHP_65,065__030315S_RHP_65,030315P_RHP,A9,65,CACGTAGGC,030315S_RHP, 066__030315S_RHP_66,066__030315S_RHP_66,030315P_RHP,B9,66,TAGAGCCAC,030315S_RHP, 067__030315S_RHP_67,067__030315S_RHP_67,030315P_RHP,C9,67,TTGTCCAAT,030315S_RHP, 068__030315S_RHP_68,068__030315S_RHP_68,030315P_RHP,D9,68,CCTGGTTCA,030315S_RHP, 069__030315S_RHP_69,069__030315S_RHP_69,030315P_RHP,E9,69,ATCAATATG,030315S_RHP, 070__030315S_RHP_70,070__030315S_RHP_70,030315P_RHP,F9,70,TGGTAACCG,030315S_RHP, 071__030315S_RHP_71,071__030315S_RHP_71,030315P_RHP,G9,71,TTCTTGACG,030315S_RHP, 072__030315S_RHP_72,072__030315S_RHP_72,030315P_RHP,H9,72,GTTCGTATC,030315S_RHP, Omixon Holotype HLA 96/7 Configuration A & CE et Configuration B & CE Guide d’Utilisation V9. Copyright© 2016, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel & Propriété d’Omixon

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073__030315S_RHP_73,073__030315S_RHP_73,030315P_RHP,A10,73,ATCCTAGGA,030315S_RHP, 074__030315S_RHP_74,074__030315S_RHP_74,030315P_RHP,B10,74,GCATTATAT,030315S_RHP, 075__030315S_RHP_75,075__030315S_RHP_75,030315P_RHP,C10,75,TGACGTCTA,030315S_RHP, 076__030315S_RHP_76,076__030315S_RHP_76,030315P_RHP,D10,76,TCAGATCCA,030315S_RHP, 077__030315S_RHP_77,077__030315S_RHP_77,030315P_RHP,E10,77,CTCTGTGGT,030315S_RHP, 078__030315S_RHP_78,078__030315S_RHP_78,030315P_RHP,F10,78,AGCGAGCGC,030315S_RHP, 079__030315S_RHP_79,079__030315S_RHP_79,030315P_RHP,G10,79,ACTCCTACG,030315S_RHP, 080__030315S_RHP_80,080__030315S_RHP_80,030315P_RHP,H10,80,CGTAACATC,030315S_RHP, 081__030315S_RHP_81,081__030315S_RHP_81,030315P_RHP,A11,81,CCGGTGTAT,030315S_RHP, 082__030315S_RHP_82,082__030315S_RHP_82,030315P_RHP,B11,82,CGGATCCTG,030315S_RHP, 083__030315S_RHP_83,083__030315S_RHP_83,030315P_RHP,C11,83,AGGCGCTAC,030315S_RHP, 084__030315S_RHP_84,084__030315S_RHP_84,030315P_RHP,D11,84,ATTCTGCTA,030315S_RHP, 085__030315S_RHP_85,085__030315S_RHP_85,030315P_RHP,E11,85,ACTTGTAGG,030315S_RHP, 086__030315S_RHP_86,086__030315S_RHP_86,030315P_RHP,F11,86,GCCTGTTGT,030315S_RHP, 087__030315S_RHP_87,087__030315S_RHP_87,030315P_RHP,G11,87,ACACGACCA,030315S_RHP, 088__030315S_RHP_88,088__030315S_RHP_88,030315P_RHP,H11,88,CAGCTCGGT,030315S_RHP, 089__030315S_RHP_89,089__030315S_RHP_89,030315P_RHP,A12,89,ATCAACCTA,030315S_RHP, 090__030315S_RHP_90,090__030315S_RHP_90,030315P_RHP,B12,90,GCGGAAGCG,030315S_RHP, 091__030315S_RHP_91,091__030315S_RHP_91,030315P_RHP,C12,91,CCTGTTAGG,030315S_RHP, 092__030315S_RHP_92,092__030315S_RHP_92,030315P_RHP,D12,92,ATCTGAGCC,030315S_RHP, 093__030315S_RHP_93,093__030315S_RHP_93,030315P_RHP,E12,93,ACCTCCTCA,030315S_RHP, 094__030315S_RHP_94,094__030315S_RHP_94,030315P_RHP,F12,94,CGCGAAGAG,030315S_RHP, 095__030315S_RHP_95,095__030315S_RHP_95,030315P_RHP,G12,95,GTTCTCCTG,030315S_RHP, 096__030315S_RHP_96,096__030315S_RHP_96,030315P_RHP,H12,96,GAATGACCA,030315S_RHP,



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Annexe 3 : Quantification instrument de qPCR

d’amplicon

avec

un



Liste de réactifs

Objet Tampon (buffer) TE 20× (pH 7.5) ADN Standard Lambda (100 ng/μL) Colorant ADN double brin QuantiFluor 200× H2O stérile à usage moléculaire Plaque(s) d’Amplification Classe I Plaque(s) d’Amplification Classe II

Conservation 4 °C 4 °C 4 °C 20 °C à 25 °C 4 °C 4 °C

Source Promega Promega Promega Utilisateur Étape 2 Étape 2



Protocole 1.

Préparer des standards d’ADN par dilution sérielle en utilisant des tubes micro centrifugation de 1,5ml et de l’ADN standard QuantiFluor “Lambda” (100 ng/μl). suivre le tableau de dilution cidessous :

Étiquette sur le ADN utilisée Volume d’ADN (μl) Volume du TE 1x (μL) Conc. finale tube ng/μL Standard 1 ADN Lambda 7,5 μl 492,5 μl 1,5 ng/μl Standard 2 Standard 1 250 μl 250 μl 0,75 ng/μl Standard 3 Standard 2 250 μl 250 μl 0,38 ng/μl Standard 4 Standard 3 250 μl 250 μl 0,19 ng/μl Standard 5 Standard 4 250 μl 250 μl 0,09 ng/μl Standard 6 Standard 5 250 μl 250 μl 0,05 ng/μl Standard 7, blanc Blanc 0 μl 250 μl 0 ng/μl

2.

Préparer des plaques de dilution d’amplicons avec des plaques à puits profonds à 96 puits (capacité de 1ml par puits). Ajouter 498 μl de tampon TE 1x dans les puits correspondants aux plaques d’amplicons. Aliquoter 2 μl d’ADN amplifié à partir des plaques d’amplicons vers les puits correspondants de la plaque de dilution d’amplicons, bien vider la pipette par pipetage. Sceller la plaque et bien vortexer. Centrifuger la plaque pendant 10 secondes.

3.

Préparer une solution 1x de colorant QuantiFluor selon la formule suivante : 0,5 μl de colorant QuantiFluor (200X) + 99,5 μl de tampon 1× TE. Préparer suffisamment de solution 1x de colorant QuantiFluor pour que chaque échantillon (total des échantillons des Plaques d’Amplicons) et que chaque standard (6 standards et 1 blanc en double) puissent avoir 50 μl d’aliquote.

4.

Aliquoter 50 μl de solution 1x de colorant QuantiFluor dans des puits dans de nouvelles plaques à 96 puits compatible avec votre appareil à PCR.

5.

En utilisant les standards préparés ci-dessous, ajouter 100 μl de chaque standard en double, à des puits individuels d’une plaque de quantification à 96 puits (14 puits au total). Mixer par

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pipetage.

6.

Ajouter 50 μl d’amplicons dilués, prélevés dans les puits correspondants des plaques de dilution d’amplicons dans les puits individuels des plaques de quantification d’amplicons. Mixer par pipetage.

7.

Placer chaque plaque de quantification dans l’appareil de PCR l’un après l’autre et exécuter un run en suivant ce programme :



Nombre de Cycles 1 2

Température 25°C 25°C 25°C

Durée 10 secondes 15 secondes 30 secondes (acquisition données)



8.

Calculer la concentration d’ADN des plaques de quantification d’amplicons grâce aux données RFU générées par le fluoromètre.

9.

Diluer l’ADN dans les Plaques d’Amplicons avec de l’H2O stérile pour que la concentration finale d’ADN soit de 67 ng/μl environ.



§

Si la concentration de l’ADN est ≥ 150 ng/μl : ajouter 25 μl de H2O

§

Si la concentration de l’ADN est 100–150 ng/μl : ajouter 10 μl de H2O

§

Si la concentration de l’ADN est ≤ 100 ng/μl : ne pas ajouter de H2O

Omixon Holotype HLA 96/7 Configuration A & CE et Configuration B & CE Guide d’Utilisation V9. Copyright© 2016, Omixon Biocomputing Ltd. Confidentiel & Propriété d’Omixon

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